设为首页收藏本站

中国兽医教育网

 找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

执业兽医
搜索
查看: 2340|回复: 1

免疫血清学技术

[复制链接]
发表于 2011-11-19 15:50:56 | 显示全部楼层 |阅读模式

学习目的和要求:
  ●重点掌握:血清学反应的概念、特点及影响因素
            凝集试验、沉淀试验、标记抗体技术及中和试验的概念、原理、类型及试验方法、实际应用。
           ELISA的原理及试验方法
       握:补体结合试验、免疫胶体金技术的概念原理及实验方法
  ●一般掌握:免疫电镜技术,核酸探针技术的概念、原理及实验方法
  
第一节  概述

  
一、血清学反应的概念

  抗原和相应抗体无论在体内或体外均可发生各种各样的反应,统称为抗原抗体反应或免疫反应。体外进行的抗原抗体反应,因抗体多采用血清,所以也称为血清学反应(Serologic reactions)。由于抗原抗体反应具有高度的特异性和较高的敏感性,因此可用已知的抗原或抗体中的任何一方去检测未知的另一方,用于畜禽传染病的诊断和微生物的鉴定。
  二、抗原抗体反应的一般规律
  (一)抗原抗体反应具有高度特异性  
  所谓特异性,即一种抗原只能和其相应的抗体相结合,不能与其他抗体发生反应。抗原抗体反应的这种特异性是抗原的决定基与抗体可变区的化学组成、空间立体构型所决定。如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合,而不能与口蹄疫病毒结合。
  当两种抗原物质间有部分共同抗原存在时,则可与相应抗体发生交叉反应。
  (二)抗原抗体反应具有可逆性  
  抗原与抗体的结合虽有相对的稳定性,但因其只是抗原物质表面的决定基与其相应抗体间的非共价键结合,又是可逆的,二者在一定条件下仍可离解,离解后的抗原、抗体各自的生物学活性不变。
  (三)抗原抗体反应需要合适的浓度比  
  抗原一般都是多价的,有1050个不等的结合点,而抗体1gM10个结合点,分泌型IgA4个结合点,IgG2个结合点,因此只有二者比例合适时,抗原抗体才结合得最充分,形成的抗原抗体复合物最多,反应最明显,结果出现最快,称此为等价带。如抗原过多或抗体过多,则二者结合后均不能形成大的复合物,不出现可见反应现象,称此为带现象。为了克服带现象,在进行血清学反应时,需将抗原和抗体作适当稀释,通常是固定一种成分而稀释另一种成分。凝集反应时,因抗原为大的颗粒性抗原,容易因抗体过多而出现前带现象,因而需将抗体作递进稀释,而固定抗原浓度。相反,沉淀反应的抗原为小分子的可溶性抗原,通常稀释抗原,以避免抗原过剩(图10-1)。
  
   
   
   
   
   
   
   
   
  
10-1  抗原抗体比例示意图

  (四)抗原抗体反应分两个阶段进行  
  第一阶段是抗原与相应抗体的特异性结合阶段,反应发生快,一般在几秒钟内或几分钟即可完成,但无可见反应;第二阶段为抗原抗体反应的可见阶段,出现沉淀、凝集等现象,这一阶段反应发生需几分钟至几小时才能完成,同时受环境因素如酸碱度、温度、电解质等的影响。为加速第二阶段反应的进行,常采用最适条件。如最适pH68,利用37℃孵育或摇震以增加抗原抗体接触的机会。电解质可消除抗原抗体复合物表面的斥力,促其相互凝聚而凝集或沉淀,呈现可见反应。故做血清学反应时,一般采用085%的生理盐水作稀释液,但用禽类血清时,需用8%~10%的高渗氯化钠溶液,否则不出现可见反应或反应微弱。
  三、影响血清学反应的因素
  1.电解质  特异性抗原与抗体表面均带有许多极性集团(如-NH+3、-COO-,它们相互结合而失去亲水性,变成疏水系统。此时易受电解质作用失去电荷而互相凝集,发生凝集或沉淀反应。因此,血清学反应须在适当浓度的电解质参与下,才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时,一般用生理盐水或8%~10%高渗盐水作稀释,才出现较强反应。
  2.温度  温度升高,可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触,加速反应的出现,故通常将抗原抗体混合后,放置37℃温箱或水浴箱中,保持一定时间,促进反应。温度高,加速反应;温度低,反应时间延长,但反应结合充分,故在补体结合反应、免疫吸附试验中,采用的低温中放置过夜。
  3.酸碱度  血清学反应通常用pH6~8,过酸或过碱都可使复合物离群,pH值在等电点时,可引起非特异凝集。
   
四、血清学反应的类型及参与成分
  抗原抗体反应的试验方法很多,不论那种方法其基本原理都是抗原与相应抗体的特异性结合。反应类型及参与成分见表10-1
  
10-1  血清学反应的类型及参与成分

  
  
反应类型

  
反应名称

  
  

  
抗体名称

  
参与反应物质

  
反应现象

  
敏感性

  
(μg/ml

  

  
凝集反应

  

  直接凝集反应
  间接凝集反应
  SPA协同凝集
  颗粒状
  可溶性抗原吸附血球上
  颗粒状、胶体状
  凝集素
  抗血清
  抗血清吸附在球菌上
  电解质
  缓冲液
  
  颗粒凝集成团块
  红血球凝集成团
  葡萄球菌凝集成团
  0.01~
  0.005~
  1.0
  
沉淀反应

  液相沉淀反应
  琼脂扩散试验
  免疫电泳
  可溶性胶体
  可溶性胶性
  性胶体
  沉淀素
  抗血清
  抗血清提取Ig
  电解质
  盐水凝胶
  盐水凝胶电解缓冲液
  颗粒状或絮片状沉淀
  两者之间形成白色沉淀线
  两者之间形成白色沉淀线
  3
  0.2
  3~0.5
  
补体参与的反应

  

  溶菌反应
  补体结合反应
  免疫粘附试验
  细菌
  颗粒状、胶体状
  胶体状
  溶菌
  补体结合抗体
  粘附抗体
  补体
  补体及溶血系统
  补体及灵长动物红血球
  细菌被溶解
  指示血球溶解与不溶解
  红血球彼此粘附
  
  0.01
  
标记抗体技术

  荧光标记抗
  酶标记抗体
  同位素标记抗体
  细菌或病毒
  细菌或病毒
  胶体或颗粒
  荧光抗体
  酶标抗体
  同位素标记抗体
  荧光素第一抗体
  酶底物及供氢体
  同位素及标记抗体
  在荧光镜下观察抗原发出荧光
  抗原显色或反应孔显色
  测定游离或结合同位素存在量
  
  0.0001
  0.0001
  
中和反应

  中和试验
  病毒或毒素
  中和抗体即抗毒素
  动物体内或活细胞中
  保护动物,无致病性
  0.01
  
五、血清学反应的应用方式和目的
  抗原抗体反应是特异性的,在应用时必须有一个是已知的,通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时,多用已知抗体。诊断传染病时,对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体;诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原(病原),如炭疽病等。
  (一)抗原与抗体的快速检测
  在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时,均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原(细菌、病毒)的存在,作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术,均能快速、简便的确诊抗原或抗体。
  (二)生物活性物质的超微定量
  应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术,对抗原抗体检测的敏感度均大为提高,已达到能精确测出pg(皮克,旧称微微克,1pg=10-12g)的水平,其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。
  (三)抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位
  用荧光抗体、酶标抗体技术,可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察,可以测定病毒在亚细胞水平的定位,也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。
  (四)微生物的鉴定与分析
  应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验,进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型,从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术,对微生物的抗原组分进行分析。
  (五)血型鉴定
  用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、Coomb实验等技术,可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。

  
第二节  凝集试验<b style="mso-bidi-font-weight: normal">
发表于 2013-7-10 16:26:15 | 显示全部楼层
谢谢,让我们一起分享好东西,大家一起多交流!
您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ|小黑屋|手机版|Archiver|中国兽医教育网 ( 皖ICP备12000803号  加速乐统计

GMT+8, 2017-10-23 16:00 , Processed in 0.523547 second(s), 19 queries .

Powered by Discuz! X3.2 Licensed

© 2001-2013 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表