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动物生化学重要技术(层析技术)

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发表于 2011-11-19 16:02:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
一 基本原理
# r+ f2 |5 F/ R(一)原理/ D; M# _4 {5 M3 S7 s$ B
层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一,它是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异,在物质经过两相(一个固定相,一个流动相)组成的体系中,不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程,可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。配合相应的化学、电学和电化学检测手段,可用于定性、定量和纯化某种物质。层析法的特点是分离率、灵敏度、选择性均很高的一种分离方法。尤其适合样品含量少,而杂质含量多的复杂生物样品的分析。固定相可以是固体也可以是被固体或凝胶所支持的液体;同样流动相可以是液体也可是气体。5 A* i; m  B# z6 `0 E- _
(二)分类2 Q+ [+ L* N$ R8 C' T% \* K
按分离的原理可分为五类:- D# |* o( P, }8 W1 d
1、吸附层析: 固定相是固体吸附剂,利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。( z- b4 p" {2 S
2、分配层析: 固定相为液体,利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。* T, i: m! N$ Z: e2 Y& v0 p7 Y' H
3、离子交换层析: 固定相为离子交换剂,利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。
- c) ]; i1 ?% K0 Z& ?4 {8 _$ @4、凝胶层析: 固定相为多孔凝胶,利用各组分在凝胶上受阻滞程度不同而进行分离。3 d$ O1 Q2 f  w- D" z9 }
5、亲和层析:根据生物特异性吸附进行分离,固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合,而与无结合能力的其它组分分离。
  S4 Y7 [7 @+ p按操作方式不同分为三类:6 Q5 I' ^9 |" F+ B
1、纸层析 以滤纸作为液体的载体,点样后,用流动相展开,以达到组分分离目的。' G6 j) i8 n7 w8 D* ?- V1 \4 d
2、薄层层析 以一定颗粒度的不溶性物质,均匀涂铺在薄板上。点样后,用流动相展开,使组分达到分离。6 T0 `+ [& N$ u& m8 w! ]# o! }
3、柱层析 将固定相装柱后,使样品沿一个方向移动,以达到分离目的。+ s: g- N; k: V, p, U5 e( Y

" G+ y5 P6 f$ d) |& n$ A二 吸附层析' t) Q9 z( [( Z
(一)原理
# z% g# T0 O4 w! y% {0 v+ U5 N吸附作用是指某些物质(称吸附剂)能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。吸附剂吸附能力的强弱除决定于吸附剂和被吸附物质本身的性质外,还和周围溶液的组成有密切关系。当改变吸附剂周围溶液的成分时,吸附剂的吸附能力即可发生变化,往往可使能吸附物质从吸附剂上解吸下来,这种解吸过程称为洗脱或展层。当样品中的物质被吸附剂吸附后,用适当的洗脱液冲洗,就能改变吸附剂的吸附能力,使被吸附的物质解吸下来,随着洗脱液向前移动,该物质又遇到前面新的吸附剂而再次被吸附,在后来的洗脱液的冲洗下又重新解吸下来,继续向前移动。经过这样反复的吸附解吸附再吸附再解吸的过程,物质就可以不断向前移动。由于吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同,它们在洗脱剂的冲洗下移动的速度也就不同,因而能逐渐分离开来。' u" K$ x6 g; M0 K6 ~( g3 E- D
(二)吸附剂的选择9 |/ J0 i  s$ g7 }) V# }* S
吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂,适合分离酸性和中性物质;氧化铝是微碱性吸附剂,适合分离碱性和中性物质;硅藻土和纤维素为中性吸附剂,适合分离中性物质。吸附剂的颗粒应有一定细度,并且粒度要均匀。一般颗粒直径为无机类0.07~0.1mm(150~200目);有机类0.1~0.2mm(70~140目)。颗粒太粗,层析时溶剂推进快,但分离效果差,而颗粒太细,展开太慢,易产生斑点不集中并有拖尾现象。
+ Z- H4 ^- p* f$ b: |; q(三)吸附能力
; O# J0 N+ _. R$ M: ^3 _/ t一般用活度来表示吸附剂的吸附能力,吸附能力主要受吸附剂含水量的影响,其由强到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。吸附剂活度强时能吸附极性较小的基团;吸附剂活度弱时对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的方法,减少吸附剂的水份,从而增加其活度。通常,分离水溶性物质时,因其本身具有较强极性,故吸附剂活度要弱一些;相反,分离脂溶性物质时,吸附剂活度要强一些。1 t. }* C2 X9 D
吸附层析根据吸附剂的装填方式可分为柱层析和薄层层析法两种。1 P5 r. k# K/ e$ W' ?
(1)吸附柱层析法 选择一根适当尺寸的玻璃管,在管的底部垫以尼龙网、玻璃棉或烧结玻璃板等,再填装一定量的吸附剂,然后在顶部加入样品溶液,待样品全部流入吸附剂内后,再加入洗脱液进行洗脱,不同组分即以不同的速度向下流动而逐渐分离开来。最后从下端出口处流出,分步收集洗脱液,即可得到各组分的溶液,供进一步处理和测定。; @" [, \. Q. `6 \% f" l
(2)吸附薄层层析法 薄层层析法是把吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层。把要分析的样品加在薄层的一端,在密闭的容器中,用适当的溶剂展层后达到分离、鉴定的目的。
7 h! V5 {- z3 b: P+ `- V薄层层析的优点是:设备简单、操作容易、层析时间短、分离效率高,是发展较快的一种微量,快速的层析方法,可用于氨基酸、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。) s# w; y3 ~6 S7 t
薄层层析的操作方法包括制薄板、点样、展层、显色等过程,薄层经显色确定斑点位置后,计算Rf值。然后与文献记载的Rf值比较以鉴定各种物质。# v2 b& [) H8 A" d  Z; B9 }( ]
  R2 p2 T9 Z  [/ p1 @* [
三 分配层析8 u8 o1 c" h( `! G# i( J+ y
(一)原理
3 K7 ^6 n9 R( O$ @在层析分离过程中,物质既进入固定相,又进入流动相,此过程称分配过程。分配层析是利用混合物中各组分在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离目的的层析技术。分配系数是指在一定的温度,压力和一定的溶剂系统中,一种物质分配达到平衡时在两个互不相溶的溶剂中的浓度比值,常用K来表示:
& y! X% L$ n% i- oK=溶质在固定相的浓度(Cs)/溶质在流动相的浓度(Cm)
1 s0 [3 x/ d2 Y& a9 P) L- o不同的层析机理,其K值函义不同。吸附层析中,K值表示吸附平衡常数;分配层析中,表示分配系数;离子交换层析中,表示交换常数;亲和层析中,表示亲和常数。K值大表示溶质在固定相中浓度大,洗脱时溶质出现较晚。K值小表示溶质在流动相中浓度大,在洗脱时出现较早。
* k: J3 y4 x- L# [7 e$ F% Y: V分配层析中常用滤纸为支持物称之为纸上分配层析。纸层析以滤纸为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力,约能吸收20~22%的水,其中部分水与纤维素羟基以氢键形式存在,而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小,所以滤纸的结合水为固定相,以水饱和的有机溶剂为流动相(展开剂)。当流动相沿滤纸经过样品点时,样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行溶液分配,由于混合物中各组分在相同条件下具有不同的分配系数,因而随流动相移动的快慢就有差异,于是就能将这些组分分离开来,形成距原点不等的层析点,溶质在纸上的移动速度可用迁移率Rf值表示:
9 U7 D* T) L0 W: K8 ^Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离7 o" h. H% k3 u* F
Rf值是物质定性的基础,一般分配系数大的组分,因移动速度慢,所以Rf值较小;而分配系数较小的组分,则Rf值较大。可以根据测出的Rf值来判断层析分离的各种物质,当与标准在同一条件下测得的Rf值进行对照时,即可确定该层析物质。* A( o1 Q: D5 ~
(二)操作要点
( O+ x+ f0 _2 n纸析法的操作分为点样、展层、显色、测定等。展层方式有单向(上行法、下行法),双向和经向(环形)之分。为了提高分辨率,纸层析可用两种不同的展开剂进行双向展层。双向纸层析是把滤纸载成长方形或方形,一角点样,先用一种溶剂系统展开,吹干后,转90度,再用第二种溶剂系统进行第二次展开。这样,单向纸层析难以分离清楚的物质,通过双向纸层析往往可以获得比较理想的分离效果。
) ^+ u+ h. \5 O* w. K纸层析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法两种。剪洗法是将组分在滤纸上显色后,剪下斑点,用适当溶剂洗脱后,用分光光度法定量测定。直接比色法是用层析扫描仪直接在滤纸上测定斑点大小和颜色深度,绘出曲线并可自动积分,计算结果。. D. m7 E) ~0 s0 k" s
! w8 I+ `; g% O( a
四 离子交换层析
, r2 D1 E0 S+ S3 v- J3 ]8 q6 D+ g(一)原理
4 s- R$ a0 c; e8 _/ }/ u5 I2 [离子交换就是指液相中的离子与固相上的活性基团离子的可逆交换反应。利用这个反应将要分离的混合物先在一定pH值的溶液中全部解离,而后流过固定相使之与固相上的离子进行交换,吸附于固相上,再根据混合物中解离度的差别,用不同pH值的溶液
2 U1 p7 M6 `* v" C$ f分别洗脱下来,达到分离混合物中组分的目的。9 n9 v' c4 y! C$ a
离子交换层析技术除大量应用于分离生物化学代谢物质的工业生产外,还广泛应用于生物化学和分子生物学的理论研究。近年来,该技术与其它技术相结合,制成了固相肽自动合成装置、氨基酸自动分析仪,核苷酸自动分析仪、气相色谱仪、蛋白质合成仪等。离子交换层析技术已经成为生化领域各个方面的基本技术之一。$ j. u1 R$ H, h- D" m+ p
(二)离子交换剂的类型
% X1 a; _* N$ p) |离子交换层析中固相称为交换剂。它是一种高分子不溶物质。目前常用的有人工合成的树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。在这些不溶性母体上引入不同的活性基团,即具有离子交换作用,成为各种类型的离子交换剂。引入母体上的活性基团主要分酸性和碱性两类,酸性基团能解离出H+可与溶液中阳离子交换。所以这类离子交换剂称为阳离子交换剂;碱性基团因能解离出OH-与溶液中的阴离子交换,所以这类离子交换剂称为阴离子交换剂。由于引入的酸性和碱性基团的强弱不同,这两类离子交换剂又分为强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型。如:酸性树脂中含磺酸基(-SO3H)的称强酸型;含磷酸基(-PO3H2)、亚磷酸基(-PO3H)的称中强酸型;含有羧基(-COOH)、羟基(-OH)的称弱酸型。碱性树脂中含季胺[-N+(CH3)3]的称强碱型,含叔胺[-N(CH3)2]、仲胺(NHCH3)、伯胺(-NH2)基的称弱碱型。) v% w! N# e" M) Q1 O% ?
离子交换剂的作用原理如下:
5 |& j/ d8 e6 {- S- u阳离子交换剂分子中具有酸性基团,能和流动相中的阳离子交换:1 d4 S* d' e3 K! ^/ ]# t8 ~
R-SO3-H++M+---→R-SO3M+H+( U" v% |8 Z8 B/ L& i: v- {
阴离子交换剂分子中具有碱性基团,能和流动相中的阴离子进行交换:3 L9 ]) X5 b8 w" g' R, r2 E8 ?
R4-N+OH-+W----→R4-N+ W-+OH-, O5 S2 r6 L% G, C& s
OH-+H+---→H2O
; f* u2 ?: ]& I9 Y( `(M+代表溶液中阳离子,W-代表溶液中阴离子)
: Z; @2 [( Z3 ~5 g由于不同生物大分子的电荷密度分布不同,电荷量不等,等电点的差异及分子大小的区别,因而与离子交换剂的结合强弱也不同,当它们被结合到固定相交换基团上以后,主要依靠增加缓冲溶液的离子强度或改变酸碱度来进行洗脱。当缓冲液离子强度增加时,即增加了它与生物大分子对交换基团竞争吸附的能力,把生物大分子置换下来,改变酸碱度,使缓冲溶液的pH接近生物大分子的等电点,其净电荷为零,从而可被洗脱。
1 I, F7 N. N5 c: V(三)离子交换层析基本操作1 E: ^+ s- S# R
1、交换剂的选择 交换剂的选择必须考虑到被分离物质及交换剂的性质,如被分离的物质是阳离子就应选用阳离子交换剂,反之则选用阴离子交换剂。溶液中的离子在交换剂中交换吸附不仅受自身电荷数的影响,也受到它与离子交换剂的非极性亲和力及交换剂空间结构大小等因素影响。因此在分离某物质时,必须根据物质的解离性能、分子大小,选择适当类型的离子交换剂。再如像分离蛋白质,核酸时,为了不改变其生物活性,要选用条件温和的交换剂,如纤维素交换剂,而不能选用交换条件强烈的交换剂,如磺酸型树脂等。4 o/ X7 m& o2 A
2、交换剂的处理、转型与再生 离子交换剂在使用前必须进行处理,即将离子交换剂先用蒸馏水浸透使之充分吸水膨胀,并用无离子水洗至澄清,以去除漂浮物及杂质等。然后用酸和碱分别处理,以除去某些不溶物。如离子交换树脂的处理方法是:先用4倍量的2mol/LHCl浸泡4h以上,除去酸液,用无离子水洗至中性,再加4倍量2mol/LNaOH浸泡4h以上,除去碱液,再用无离子水洗至中性备用。离子交换纤维素则用0.5mol/L的NaOH和0.5mol/LHCl处理。离子交换葡聚糖凝胶一般不用酸碱处理,使用前需在中性溶液中完全膨胀(室温1~2天,沸水浴2h)。处理过程中不需去除细小颗粒。避免强烈的搅拌,清洗时,最好用布氏漏斗除滤液,代替倾注法以减少损失。- e! u$ `" y8 U  ~
用过的交换剂,经处理后还可继续使用,处理过程称为“再生”。一般是用酸和碱分别浸泡,再用水洗至中性。但离子交换树脂不一定要用酸和碱处理,即只要“转型”就可以了。所谓转型就是使用时希望树脂带上何种离子。如希望阳树脂带Na+,则用NaOH处理;如希望树脂带H+则用HCl处理;希望它带NH4+,则用NH4OH或NH4Cl处理。阴树脂转型也是同样道理,若希望带Cl-则用HCl,希望带OH-则用NaOH。总之,树脂处理,再生和转型的结果是希望带上我们需要的离子,因此最后的处理即是转型处理,不论转为何型,前后都要用无离子水洗至中性(若最后一步用碱处理,水洗至流出液pH<8;用酸处理的,水洗的流出液pH>6即可)。
) u" \! Z9 x; q5 e- q) y3、装柱 离子交换层析多用柱层析法。首先应将柱放垂直,在柱内装入1/3的溶液,然后将处理好的交换剂用溶液稀释,一边搅拌一边加入柱内,使交换剂均匀沉降,至交换柱高1cm左右,打开下口,使溶液慢慢流出,同时不断地加入搅匀的交换剂,直达到要求的柱高为止。装好的柱要求没有明显的分界线,不能有气泡,柱床面要平坦。装好的柱床面上要保持一层溶液,以防空气进入。5 \, x. J+ U' o, U! ]1 J- F
4、样品上柱 柱装完毕后,用所需的缓冲液平衡,上样时应把柱面上的溶液放出,至液面与柱床面相同高度,用滴管加入样品,打开下口,使样品进入柱床,当样品液与柱床面相平时,用少量缓冲液洗管壁,这样使样品全部进入柱内,以防止出现拖尾现象。! q/ N1 {# ^" Y( h
5、洗脱 一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团,从而把吸附物质顶替出来,利用此原则选择各种洗脱液。洗脱液是由不同离子强度和不同pH的缓冲液组成,用以分离样品的不同组分。改变洗脱方式主要有分步洗脱(或分段洗脱)和连续梯度洗脱法。
5 H" @- l1 E) _5 k(1)分步洗脱法 预先配制不同离子强度的缓冲溶液,分段换用离子强度由低到高,pH相同或不同的洗脱液以洗脱生物大分子的各种组分。
9 [( K' ^) u2 Q( u) ^- q) }; j(2)梯度洗脱法 早期采用两个直径相同底部相通的大型容器,将离子强度低的缓冲溶液放入一容器(混合瓶)中,其下端装有一个搅拌器,并连接到色谱柱的顶端,另一个容器存放离子强度较高的缓冲溶液。在洗脱过程中,因缓冲液由贮存瓶不断流入经搅拌器的混合瓶中,使流入色谱柱的洗脱液离子强度呈梯度增加,而pH亦逐渐变化。这样可分管自动收集,使结构相近的生物大分子较易分离。
9 m- y& J( j9 m3 E4 P5 D近期,人们已设计出了可以自动梯度洗脱的分离洗脱,具有非常好的重现性。1 U7 y1 L/ o# B) ^0 N7 I2 ~
- A! h  X& \4 G- }$ S& a
五 凝胶层析" @' g5 |7 ~! V" l6 B5 O$ k
(一)原理
6 O0 k2 v( A5 D  Z凝胶层析是20世纪60年代发展起来的一种分离分析方法。其法有许多同义词,如凝胶过滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析等。
; L; z  g) l$ M, t( T% e/ R( ^凝胶层析是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。凝胶的孔隙犹如“筛眼”。当被分离的物质流过凝胶柱时,分子大于凝胶“筛眼”范围的物质完全被排阻,不能进入凝胶颗粒内部,只能随着溶剂在凝胶颗粒之间流动,因此受到的阻滞作用小,流程短,流速快而先流出层析柱;分子小于“筛眼”的物质则可完全渗入凝胶颗粒的“筛眼”中。因此,受到的阻滞作用大,而且从一个颗粒的“筛眼”又进入另一颗粒的“筛眼”,其流程长,流速也就慢,从层析柱中流出就较晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。从流出先后次序的不同即可达到分离和纯化被分离物质的目的。
1 G& F: f# X$ b; _8 u: S凝胶的这种特性又称分子筛效应。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中,颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子,当洗脱体积为Vo时,出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi,能全部透入凝胶的那些小分子,当洗脱体积为Vo+Vi时出现洗脱峰,介于其间的分子将在洗脱体积为Vo+Ve时,出现洗脱峰。1 y  d: j* Q) K4 q6 i- s
我们将分子筛分配系数定义为:K=Ve/Vi
3 o: w" d' _2 J6 x6 F若生物大分子的分子为球形,其K与生物大分子的相对分子质量Mr存在如下关系:
' L7 M$ ]7 x# ~4 NK=-blgMr+c9 A. |' ?6 j/ L3 _
其中b和c为常数。实验已证实这一关系的存在。2 a/ q9 Q# s& M' R, V
(二)凝胶的种类
  B4 Y8 h( y! V用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖。6 z5 n8 k- i! w4 m4 o
1、交联葡聚糖凝胶9 e* d! P' x  s5 r
交联葡聚糖商品名为Sephadex,它的原料是细菌分泌的链状葡聚糖。通过交联剂1-氯代-2,3-环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多,孔径越小,吸水量也就越小;反之越大。商品Sephadex以G值表示不同交联度,G值越大,空穴也越大,G后边的数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍,G-25表示每克干胶可吸附2.5g水。
3 ]* ^! Z1 K- `7 \一般将SephadexG-10至G-50的凝胶称为硬胶,因其吸水量比较小;而SephadexG-75、G-200由于吸水量大,膨胀度较大,称之为软胶。
+ Z0 F) t; S; K层析时选用何种凝胶,需根据被分离物质分子的大小及分离目的不同而决定。一般把用于小分子物质如无机盐从有机大分子中分离出来的层析,多使用“筛眼”小的凝胶如SephadexG-10至G-50;分离分子大于10 000以上的两种分子大小近似的物质时,使用“筛眼”大的G-75以上的凝胶。7 u! l& P, h- ^3 H2 q
凝胶基本上是一种不带电荷的球状物质。本身不会与被分离的物质相互作用,所以分离效果好。但葡聚糖凝胶分子上含有的羟基,能与某些蛋白质的碱性基团相互作用,吸附少量蛋白质。为此,在洗脱时可在洗脱液中加入氯化钠等中性盐,提高离子强度,当离子强度大于0.05时即可克服这种吸附。
- a$ g8 v! R( V0 O9 E2.聚丙烯酰胺凝胶% Z& I$ p, y$ o- u
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺和N,N′-次甲基二丙烯酰胺聚合而成。其商品名为生物胶P(Bio-GelP)。其孔穴大小也是随交联增多而减少,并用P值表示不同的交联度。P值越大,孔径也越大。5 C& n# }! U: l  o% i/ _
3.琼脂糖凝胶
" t2 A+ k  |" b9 c! K" ~琼脂糖是从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性组分。它是D-半乳糖和3,6-脱水L-半乳糖相间重复结合而成的链状化合物。
: k$ _/ x2 H3 t) t' |这种糖链依靠糖基之间的氢键作用,形成稳定的网状结构,网状结构的疏密依靠改变琼脂糖浓度的方法来控制,因此商品也是以含水状态供应。因为琼脂糖凝胶靠的是氢键相交联,一般型号只能在0~40℃以及Ph4~9范围内使用。近年,应用交联剂制备得到的cl型和FF型琼脂糖则有比较好的稳定性,能用于浓脲、胍、有机溶剂及非离子型去污剂溶液,还能经受110~120℃高压灭菌处理,对生物大分子的吸附能力也特别低。无论是哪种琼脂糖凝胶,其机械强度都比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶好得多,同时它对生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外,琼脂糖凝胶适用相对分子质量的范围宽,最大可以到108,这一点是另外两种凝胶所无法达到的。正由于以上这些优点,它的应用受到人们的重视。琼脂糖的商品名为Sepharose或Bio-GelA。
: W1 D  i& s3 Y6 W- K5 j  h/ c7 @(三)操作方法; n( h# p2 k2 |" W. N
1、凝胶的处理 为了获得合适的流速和良好的分离,凝胶粒子在使用前需经一定处理,主要是将凝胶的保存液更换到分离蛋白质的洗脱液中,对于Sephadex系列凝胶在使用前需充分的膨胀与浮选。* O( ^- \, ~  O  j2 T7 s5 Y; w/ M# B2 |
2、装柱 取适当长度的色谱柱(G-200选用2.5cm×100cm),底部铺上尼龙筛网或玻璃丝,以不漏粒子为准。用缓冲液(如PBS)饱和凝胶粒子,置室温1h后上柱。自顶端倾注凝胶悬浮液时,应沿直插到管底的玻璃棒缓缓流入,以免产生气泡与漏出粒子。为了防止分层,最好将凝胶悬液放于贮液瓶中,连续加入。
: m% r! C7 B1 E7 M* {3、柱填充的检查和Vo的测定 检查柱子填充是否正确的最好方法是用此柱分离某些有色物质。蓝色葡聚糖-2 000是常用的一种物质,它是一种高分子葡聚糖,含有蓝色发色基团,因此可在一次操作中检查柱子的填充状况和测定出滞留容量Vo。方法是把0.2%的蓝色葡聚糖-2 000溶液(1/50~1/100柱床体积)加到柱子上,洗脱液的离子强度应为0.02或更高。在色谱分离过程中,可能出现的色带形状。柱子填充良好是获得好的分离结果所必需的。如果用蓝色葡聚糖进行实验后获得了一个不好的色谱带,那么就说明凝胶床没有填好。在这种情况下,柱子必须重新装填。
& i3 o% i. H& e' h5 k" B$ P9 i6 E- Z4、加样 在加样时,为了不扰乱凝胶表面,可在顶部放上一层圆形滤纸或尼龙网,也可覆盖一层SephadexG-25(5mm厚)的凝胶。样品要有一定的浓度和体积。通常为床柱体积的1%~10%,浓度不宜超过1%~4%。7 Q, p. \0 T3 E& E; U( X* }$ ^
5、洗脱 洗脱剂多采用低离子强度的盐溶液。各种类型凝胶对流速要求不一。/ L5 A) a, J8 W# F3 ~
6、再生 样品洗脱完毕后,凝胶柱即已再生。一次装柱,可反复使用多次。因此操作简便,重复性高。7 i$ H1 ~3 ^; z
7、保存 各型凝胶悬液加防腐剂或灭菌后,可置冰箱保存数月。防腐剂类型很多,最常用的有0.02%的叠氮化钠与0.05%的柳硫汞等,也可用高压蒸汽0.1MPa 30min灭菌。% @2 L0 n" R! R# C) V' _9 |+ O
(四)应用9 m% R$ h3 l  {+ a6 d/ A8 @
凝胶层析是一种快速、简便的分离分析技术。由于设备简单,操作方便,不需有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果,广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、激素、抗生的素、生物碱等物质的分离和提纯,也可用于蛋白质溶液的脱盐及高分子溶液的浓缩、蛋白质相对分子质量的测定等。) V3 o5 d8 Q. U* C! a; L+ A: R
6 c/ N! i3 d) M( |. c3 r2 h
六 亲和层析- o1 r8 V: y9 S) x$ i0 L& ^+ Y
(一)原理
. x0 E1 J+ q& S* S7 F3 L1 s亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法,也叫做生物亲和或生物特异性亲和层析。这种特异可逆结合的物质很多(见表).如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等,生物分子间的这种特异亲和能力又叫亲和力。
* B" n# p" [+ R7 J2 H
) M: e/ Y" k$ s( N4 `亲和层析所用体系
) M' P" W( G, b/ O  
  常 用 配 体
7 W) d( L+ v7 V: N" J0 z+ L
  分 离 对 象   : u6 E8 c0 B2 U# l
  酶
) g  q  d6 n1 }5 j3 o3 P6 i( n' e
  底物、抑制剂、辅酶 8 H2 i6 W7 m7 X" K7 W2 y  P4 a
  抗体
' L4 q1 ?( M. {* O/ z; W0 s
  抗原、病毒细胞
  {- C2 B) U, {1 e: e! e
  核酸
6 u( r; d  Z2 q' D0 R. Y
  互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白 * P, q, f/ q# C5 t' ~  A
  激素
: O( b7 i, Z( X* m; P% a& f
  受体、载体蛋白 # T& Z9 B$ e/ Q9 \
  细胞 2 L* Q: l3 D" v: `# J4 A$ @- p
  细胞表面特异蛋白
- B7 i9 x. `& G3 k# f
* D5 J! V. ?$ a# p

3 ]% v9 C% A( V亲和层析中,一对互相识别的分子互称对方为配体,如激素可认为是受体的配体,受体也可以认为是激素的配体。2 A- P+ f" x5 F8 k5 }" [
亲和层析是将配体固定在固相载体上,并且将其装入层析柱中,当样品通过层析柱时,由于配体和相对应的生物大分子有专一性的亲和作用,将某种生物大分子吸附在柱中,样品中的其他组分不产生这种专一性的结合,而直接流出色谱柱。然后,便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
9 u( R0 b) g  f4 s9 ^8 j# t亲和层析法具有高度的专一性,而且层析过程简单、快速,是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
1 \3 e+ B: V, c6 ?# V3 b; q* U# z(二)操作方法2 w) s1 }: v/ S( c
亲和层析的分离方法随分离的物质不同而不同,一般的程序如下:* a. E  \. u+ o/ e# b* n
选择配体→选择偶联的凝胶→偶联配体→装柱→平衡→上样→洗涤未结合的杂质→洗脱目标物质→样品。9 R  @# Q9 ^1 q
1、配体的选择 能与分离物质牢固、特异和可逆结合的物质都可以作为配体。选择配体有两个条件:
% k. f0 [, f- C9 q第一,生物大分子与配体间具有合适的亲和力,亲和力太强,洗脱条件剧烈,易造成生物大分子失活,亲和力太小,解离容易,结合率不高;1 r3 H; ^4 [5 E
第二,是配体要具有双重功能,既有可牢固与载体结合的基团,结合后又不影响生物大分子与配体间的亲和力。
- t' H4 L6 k; |% y" {2、载体的选择及与配体的偶联 : e- ?8 ]5 r! _
对于一个成功的亲和色谱分离来说,一个重要的因素就是选择合适的固体载体。( Q# e+ [$ m# o/ N$ c
实践证明,琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放,通过性好,酸碱处理时相当稳定,物理性能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐,并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体。亲和色谱中最为常用的琼脂糖凝胶的型号是Sepharose-4B。在琼脂糖与溴化氰活化后,再与生物大分子结合形成亲和色谱填料是亲和色谱中最为常用的一种。
0 c4 j: N- ]% [( O5 G1 e3、装柱、上样 亲和色谱吸附剂制备好后,装入色谱柱中,色谱柱无特殊要求,常用短而粗的柱子。根据纯化物质的量、吸附能力来选择。吸附能力高的常用短柱,吸附能力弱的常用长一些的柱子。
1 K9 m/ T; M. D& L+ f: A. L8 {样品为固体时,常用起始缓冲溶液溶解,若为液体,要通过透析等方法将溶液转换为起始缓冲溶液。上样量可根据柱子的吸附容量来推算,通常为吸附容量的1/3或更低,对于吸附力弱的物质,上样量按照1/10为佳。在样品上柱后,使用10倍柱体积的缓冲溶液将不结合的杂质清洗掉获得最尖锐的洗脱峰和最小洗脱体积的流速为最佳流速。/ X5 r8 ?) Z/ w0 U* b0 `# X
4、洗脱 从柱中洗脱目标产物是亲和色谱是否成功的关键。通常采用降低目标产物与配体之间的亲和力的方式进行洗脱。可用一步法或连续改变洗脱剂浓度的方式将目标产品洗脱下来。当蛋白质与配体间的作用力过强时,可用一步法,甚至可先让洗脱剂在柱子中停留半小时的方法。/ E( T; R8 b! H+ c
改变pH同样也能改变配体与蛋白质间的作用力,因此通过改变pH也是亲和色谱分离目标产物的一种方法。另一种方法是通过改变离子强度来洗脱目标产品,有时也用变性剂来洗脱目标产品。因此,亲和色谱分离目标产品的方法并不是一成不变的,可根据样品的性质和自己的条件进行选择。' I/ \) L4 d$ n8 u! w5 k0 l
对于吸附得十分牢固的生物大分子,必须使用较强的酸或碱作为洗脱剂,或在洗脱液中加入破坏蛋白质的试剂,如脲、盐酸胍。这种洗脱方式往往造成不可逆的变化,使纯化的对象失去生物学活性。因此,对于洗脱得到的蛋白质溶液应立即进行中和、稀释或透析。
0 Z2 e) @  A- N
* f* ^$ x, U( O0 _. q七 高效液相色谱法
# s) j$ H5 h3 }8 w- o高效液相色谱(HPLC)又叫高压、高速、近代液相柱色谱,但常叫做高效液相色谱。它是20世纪60年代中期才建立的一个高效快速分离化合物的方法,广泛地用在生物大分子的分离和纯化方面。在分离生物大分子时HPLC与经典的柱液相色谱比较具有以下几个优点 ①分辨率高:一根长10cm的柱子可以分离十几种以上的物质;②速度快:物质的分离与纯化一般在1h内就可以完成,甚至只需要几分钟时间,其流速一般为1~10ml/min或更高;③重复性好:HPLC在分析生物大分子时结果误差小于5%;④适用面广,灵活性强:几乎所有的生物大分子根据它们的性质差别(等电点、疏水性、相对分子质量、电荷分布等)都可以使用不同的HPLC方法进行分离提纯,在一定的条件下,还可以保持其高的生物学活性,且极易回收;⑤灵敏度高:HPLC已广泛采用高灵敏的检测器,加上仪器本身集分离和富集于一身,使生物大分子的最小检测下限非常低。紫外一般可达10-7g,荧光可达10-9g。这些是HPLCHPLC特有的优点,使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。1 N, K) W( f- C1 w
(一)原理/ X8 |. f/ n5 `/ B) T& h2 h, W2 h
HPLC法的分离原理与经典色谱(即层析法)相同,主要是各种溶质在色谱柱中,差速迁移的结果。这种差速迁移现象,是样品在固定相和流动相之间分配不同所引起的。5 ^$ M& l# t+ E0 U
按照分离机制,可将其分为:
- z; ^  a5 l5 c: j7 ~(1)高效离子交换色谱(HPIEC)(2)高效反相色谱(HPRPC)(3)高效疏水作用色谱(HPHIC)(4)高效排阻色谱(HPSEC)(5)高效亲和色谱(HPAC)。它们的主要特性见表。
# ^3 {- ^" z- q  z! o2 c% a3 |/ L4 t3 _+ E4 k1 I' {
生物大分子在不同HPLC上的分离机制及其操作条件间的关系
2 A6 g7 g. s" s& `! [  
  色谱类型 7 ], D7 ?/ ^7 u2 L2 b+ p
  分离机制
& C6 S. F: V! L& l3 A* M! [
  操作条件
; }" o" e( L: T1 N
  9 ?) Q3 V/ ~3 Q' K. c) t7 N9 i
  
9 q$ I$ Q5 ^: w! {2 m  {
  固定相上的基团 6 o' [% q% w& `# X; k, z
  流动相
' z$ K7 o- w  f% [& y9 J% k
  HPIEC
; |! r$ i4 p; W) {7 p0 W) v8 x
  静电作用和电荷分布
( |9 g4 Z% f4 X  _2 Z0 }( z0 }
  带电荷的阴、阳离子 + h- ]# Z( y& q
  盐水溶液
+ }" A+ v4 z* M; k
  HPHIC盐水
0 o- z* w2 w1 I3 l/ a
  疏水作用 ( u- b/ Q% ?! \/ B; P2 x) ~
  极性非极性相间
1 O; Q4 g# ^1 ^: {/ s
  有机溶剂(弱极性或非极性溶液 ' k  u- _( h4 u- f- l% ?
  HPRPC: D7 E1 D( ^' I- _- }1 X9 n- j
  疏水作用
4 o; b- J0 _9 W5 R+ p' P; D/ V. ], E4 ?% l
  非极性 : Q" ~0 z! T% C) l
  有机溶剂、水
+ s7 }# z3 Y9 ^7 W# U3 A7 D6 V1 f. [, U
  HPSEC9 W- g* m1 a) J' A
  分子大小和形状 ' H9 H9 ?% u6 S6 I. o
  惰性 ' `( k( w5 r$ Y3 Z0 q3 w
  盐水或有机溶剂、水 , I5 X9 x1 j: y; {& J" e: W
  HPAC
3 E1 w% I  K9 [# E
  分子间特异的亲和力
6 u' Y+ o- M# _' h6 O2 w% e
  亲和配体 $ G7 ^( B* I9 n- k1 [
  盐水溶液 5 w1 p( F! s" q
  
, d  t' `6 A# Z! l  {; G
  
. ~; r6 t, f) I* d2 z
  0 w- T, z, S& T: h: k9 u1 E
  3 R4 X5 ~* U/ t. d9 B, h
$ x9 c: i) x- t) ^9 j: K
(二)高效液相色谱仪% K+ {8 k2 _8 @% K
高效液相色谱仪是20世纪60年代后期发展起来的一种分析仪器。设备中的基本部件有输液泵、色谱柱和检测器。但为了能得心应手地工作,仪器应当适应多功能的要求,同时配有梯度装置、部分收集器、恒温系统、数据处理系统以及控制系统等部件。: P4 X; Z# Z- U/ y9 {4 W
1.贮液装置 贮液装置是用来贮存足够数量的洗脱液,供分离物质之用。商品型是用不锈钢制成,常附有脱气设备,如搅拌、加热、抽真空、吹氮气等。自制可用玻璃瓶代替。& p3 ?8 S' X, g
2.输液泵 泵是HPLC设备中重要的部件,是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源,其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性
, L2 l& K: H$ D; R, s% b3.梯度洗脱装置 梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂,按照一定时间程序来改变配比浓度,以达到提高洗脱能力、改善分离效率的一种有效方法。梯度洗脱技术在高效液相色谱分离生物大分子中有很重要的实用价值,特别在分离多组分的生物大分子样品时,各组分的k′值相差很大,很难用一种固定配比浓度的溶剂获得良好的分离,无法将各组分的
( f' e3 X- a' I1 \, w# tk′都控制在有效的范围内。采用梯度洗脱可以按一定程序,改变溶剂的极性和洗脱强度,使各组分k′值均可控制在最佳条件,不但能提高分离效果和改善峰形,而且可缩短分析时间。梯度洗脱中,后被洗脱的组分比它在相应的等浓度洗脱中的峰形更尖锐,因此检测的灵敏度更高。
6 v' [' A! W* ~5 Q, T4 R# _6 ^4.色谱柱 色谱柱是HPLC的核心部件,要求分离度高,柱容量大,分析速度快,而这些性能不仅与柱填料有关,也和它的结构、装填、使用技术有关。
7 B0 O7 B1 o1 k理论上,色谱柱越长,柱的分离效果越好,但由于固定相的粒度对柱长产生了限制,在目前的条件下,只能保证10~25cm长的柱子可获得好的重现性和结果。色谱柱的内径国外常采用4.6mm,国内常采用5mm。随着色谱,技术的发展,内径2mm的色谱柱已作为常用柱径,因为,它可以获得与粗径色谱柱基本相同的分离效果,而其溶剂的消耗量仅为5mm柱子的1/6。2 c- d, h( G9 k8 y8 T+ k
5.进样器 待分析样品从柱前的进样器进样,可用注射器进样、阀进样和自动进样器进样三种。其中注射器进样和阀进样最为常用。3 M( Q, E+ b9 T  o
6.检测器 被分析的组分从柱子流出以后该组分在流动相总的浓度的变化可通过检测器转化为电信号或光信号而被检出。检测器必须具有足够灵敏度,而且适应条件范围比较广泛。最常用的检测器:% J1 a1 U, P/ p0 ]; i5 J- W
(1)紫外吸收检测器 凡是有紫外吸收的化合物都可以使用。
) J0 O6 k* Q% F4 `, X(2)示差折光检测器 多用于脂质、糖类物质的测定,缺点是对温度特敏感。
1 m: F) R5 Q) l  \4 J( `(3)荧光检测器 是一种受干扰小,灵敏度很高的测验器,只要能在紫外光激发下发射荧光的溶质都可以使用,适用于各种氨基酸、胺类维生素、甾醇化合物的测定。
: ^! O1 i: L1 k(三)色谱方法的选择* l7 \# J6 I' ]5 B4 ]
待分离样品对色谱法的选择主要基于样品的物理化学特性及溶解度。对于一个未知样品,首先要大概了解它的分子大小,然后进一步试验其溶解性能。根据分子大小和溶解性能便可粗略地选定一种色谱柱进行初分。. X8 r- v8 y4 N0 [! i1 F
一般来说,吸附色谱法多适用于非极性样品,它的柱容量主要决定于吸附剂表面的大小。离子交换色谱法和液-液分配色谱法多用于水溶性样品。柱容量分别决定于离子交换量和固定相中固定液的体积。凝胶过滤色谱法可根据填料的性能不同分别用于亲水和亲脂性样品。但以上选择也不能绝对化,如吸附色谱的填料经过特殊处理后也可以吸附很强的不溶性化合物,液-液分配色谱的正相和反相就可以分别用于分离极性和非极性化合物。关于对色谱方法的选择,可结合有关色谱专业书籍参考选择。9 q3 d+ s8 u0 u- T% N1 L
(四)操作及注意事项! |% j! U2 ]3 E& D. `9 u+ ]
1、进样前准备工作 各种溶剂一般要求新鲜配制,使用前要脱气处理,样品进样前,必须用流动相充分清洗柱平衡系统。样品用与流动相相同或互溶的溶剂完全溶解。进样前样品要用微孔过滤器过滤。. a$ z6 q% K$ R9 A( q8 f
2、洗脱 进样后洗脱条件常按事先计划好的溶剂程序进行。' S5 B( P% D3 l0 m- v
3、柱的清洗及保存 色谱分离完毕后,要用溶剂彻底清洗色谱柱,或色谱柱用后存放时间过久也应定期清洗。
( @: P6 G/ [& c0 g: M6 u* pHPLC法的应用,除了认真了解仪器的设计原理和各种色谱柱的性质、应用范围外,要真正掌握好这门技术,还要通过大量实验才能得心应手。目前国内外HPLC仪和色谱柱型号繁多,每个厂家对自己的产品都有比较详细说明和应用举例,只要遵守操作规则及结合有关色谱的原理加以具体运用,在短期内掌握仪器操作开展实验工作是不困难的。
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