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不同诱导因素下生产猪干扰素的研究思路

来源: 人气: 发布时间:2016-11-03
摘要:上海农科院 畜牧 所成功地在一株甲醇利用慢型 (methanol utilization slow,MutS)毕赤酵母载体上克隆表达了 pIFN-α,摇瓶条件下的最高抗病毒活性达到 2.1×104IU/mL。笔者所在课题组将智能型模式识别控制系统(Artificial Neural NetworkPattern Recognition
    上海农科院畜牧所成功地在一株甲醇利用慢型 (methanol utilization slow,MutS)毕赤酵母载体上克隆表达了 pIFN-α,摇瓶条件下的最高抗病毒活性达到 2.1×104IU/mL。笔者所在课题组将智能型模式识别控制系统(Artificial Neural NetworkPattern Recognition based Control, ANNPR-Ctrl)运用于重组毕赤酵母的生长阶段,为高密度发酵的实现搭建了良好的通用平台;对该菌株表达目标蛋白时的最适甲醇浓度水平进行了优化(10g/L);采用 20℃低温诱导策略,使总蛋白产量提高 2~3 倍,最高 pIFN-α抗病毒活性提高近 10 倍,并探索了 20℃低温诱导模式下碳代谢和能量代谢的变化情况,明确了低温诱导可以提高能量(ATP)再生效率和发酵性能,在 20℃低温,5L 罐下通入富氧空气时进行发酵,使 DO 水平控制在≧50%的水平,其最高抗病毒活性可达3.6×107IU/mL,目标蛋白产量可以达到 1.375g/L。在此基础上,本人又进一步尝试了山梨醇/甲醇共混流加诱导这一发酵控制策略,研究结果显示,共混流加诱导下的最高总蛋白浓度是 20℃低温诱导的 3 倍,pIFN-α 抗病毒活性是 30℃甲醇单独诱导下最高活性的100 倍以上。
    虽然低温(20℃)诱导可以改变甲醇代谢中的代谢流分布、加大蛋白合成支路的碳代谢通量、提高能量(ATP)再生效率和目标蛋白的浓度。但是,由于此时 ATP 的供给需求大幅增加、耗氧量激增,导致规模发酵(10-100L)下的操作成本(冷却和供氧能耗)急剧上升。山梨醇/甲醇共混流加诱导可缓解甲醇作为唯一能源对细胞工作运转的供能压力和目标蛋白的降解,同时还对醇氧化酶 AOX 具有一定程度的可逆性抑制作用、可以对甲醇代谢速率进行适度调控。理论上,这可以缓解低温诱导条件下,溶氧需求过高、温度和溶解氧浓度(DO)难以控制的问题。另外,山梨醇/甲醇共混流加诱导究竟是如何、通过何种途径来提高目标蛋白(pIFN-α)的浓度或活性的,其代谢和酶学机理尚不明确。
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    围绕以上问题,在国家重点基础研究发展计划 973 计划 (No.2007CB714306) 和上海市科学委员会农业科技重点项目 (No.07391908) 的资助下,课题组以提高pIFN-α抗病毒活性、降低发酵成本为目标,重点探讨了 10L 罐下,山梨醇/甲醇共混流加诱导对毕赤酵母生产猪 α 干扰素产能途径改变和发酵性能改善的影响,为 pIFN-α 的产业化生产提供参考和借鉴。主要研究内容包括:
    1) 在通用的高效发酵平台下,通过多批 10L 罐下毕赤酵母发酵生产 pIFN-α 的实验,研究 30℃/20℃甲醇单独诱导和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 pIFN-α 发酵生产性能。采集发酵表观参数碳源比消耗速率、耗氧速度(OUR)、CO2、释放速度(CER)、呼吸商(RQ)等,检测发酵结果目标蛋白量、抗病毒活性,考察 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略在目标蛋白产量、抗病毒活性、发酵工艺和发酵成本等多方面的优势。
    2) 使用通用的标准测量方法检测不同条件下毕赤酵母诱导期关键产能途径的关键酶活性,通过该活性数据分析不同条件下毕赤酵母的主要供能途径,得出 20℃甲醇单独诱导下的主要供能途径为甲醛异化途径,30℃、甲醇/山梨醇共混流加下主要供能途径为TCA 循环,并重点分析后者在诱导期主要供能途径如何由甲醛异化途径转向 TCA 循环。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net
    3) 结合上述两方面的数据构建 30℃/20℃甲醇单独诱导和 30℃甲醇/山梨醇共混流加三种模式下的代谢模型,计算三种模式下的碳代谢流分配比、理论耗氧速率和能量效率,得到甲醇/山梨醇共混流加下走向 pIFN-α 蛋白合成的碳代谢流分配比例和能量效率明显提高,理论耗氧速率明显降低的结论。为 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略的高产提供了理论依据。
    4) 通过检测不同诱导策略下中间代谢毒副产物甲醛、甲酸的胞内积累以及毕赤酵母产能途径关键物质浓度来验证产能途径的变化。20℃甲醇单独诱导条件下甲醛异化途径的副产物甲醛、甲酸和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 TCA 前体和关键物质浓度的积累量相对较高,分别对应不同条件下相对活跃的供能途径。
    5) 研究了不同山梨醇流加速率对毕赤酵母代谢途径的影响。证实了文中对最优山梨醇流加速率的选择。改变山梨醇流加速率会对毕赤酵母的代谢产能产生明显的影响,应该将山梨醇流加速率控制在最佳水平。
    由于国内外关于毕赤酵母代谢模型分析的文献报道集中于常规发酵过程,极少有针对高效的诱导策略下发酵过程进行代谢分析。因此此次研究将对不同诱导策略下的毕赤酵母发酵过程代谢分析方法的建立起到重要的参考意义。在发酵工艺方面,开展10 L罐规模下毕赤酵母高密度流加培养发酵生产pIFN-α酶学、碳代谢、能量代谢方面的系统研究,该研究的目是为形成高效和批量化的 pIFN-α发酵生产体系提供理论依据,并可为 pIFN-α 的商业生产提供一定的借鉴和参考。
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