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检测四种禽呼吸道疫病病原可视化芯片构建及初步应用

来源:四川农业大学动物医学院动物传染 人气: 发布时间:2016-11-05
摘要:引言 禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)是引起鸡呼吸道疫病的常见病原,四种疫病的同时诊断对临床防控具有重要意义。本研究是在基因芯片技术的基础上结合不对称PCR 技术,将生物素标记的不对
引言
禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)是引起鸡呼吸道疫病的常见病原,四种疫病的同时诊断对临床防控具有重要意义。本研究是在基因芯片技术的基础上结合不对称PCR 技术,将生物素标记的不对称PCR 扩增产物与寡核苷酸芯片杂交,然后与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)包被的链霉亲和素反应,用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)对该杂交体系显色后,阳性信号能够以肉眼可见的棕色斑点呈现。该研究建立的可视化寡核苷酸芯片技术,为鸡呼吸道疫病的临床诊断提供了新的技术。
材料与方法
本研究对AIV 的保守基因NP 设计一对特异性引物,以分离株H9 为材料提取RNA,反转录得到cDNA 后,经PCR 扩增、连接、转化和核酸序列鉴定后,克隆出AIV-NP 基因的重组质粒,同时复苏本实验室前期保存的NDV 的F 基因、IBV 的N 基因和ILTV 的TK 基因的冻干重组质粒菌。并以上述四种靶基因核酸序列片段的正义链为模板,设计寡核苷酸探针,喷样到尼龙膜上制备成芯片。利用不对称PCR 技术扩增生物素标记的靶基因与芯片进行杂交,用肉眼判定结果。并对对芯片制备和芯片检测技术中的各项检测条件进行优化。
结果
当喷样次数为1 次;探针浓度为25μM;杂交时间为1h;杂交温度为50℃;浓度为1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate 稀释2000 倍;DAB 显色时间为5min 时,芯片检测技术的结果最佳,确立了共检芯片技术检测的标准条件。对构建的AIV-NDV-IBV-ILTV 共检可视化芯片进行了特异性、敏感性和保存期研究,结果表明,本研究所构建的芯片特异性良好,各靶基因之间没有交叉反应;敏感性试验结果显示最低可检测出靶基因浓度为1.0×10-5μg/μL;随机抽取保存不同时间的3 张芯片进行检测,结果该芯片在保存180d 时仍可检测;采用本研究所构建的可视化芯片技术和实验室常规的RT-PCR/PCR技术同时对采自川渝地区的96 份临床组织样品进行检测,结果两种方法的检测结果符合率为100%,表明该研究构建的可视化寡合苷酸芯片,能够用于临床样本的检测。本研究构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化寡核苷酸芯片,为鸡病诊断提供了新的技术。
责任编辑:文心田

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