首页 新闻 行业 养殖 诊疗 宠物 兽药 教育 图谱 视频

药理

旗下栏目: 药理 研发 应用 实验

猪细小病毒检测方法的研究进展

来源:网络 人气: 发布时间:2016-09-24
摘要:猪细小病毒(PPV)是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染

猪细小病毒(PPV)是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染病。临床主要表现为胎儿感染死亡,产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等症状.还可致皮炎和腹泻。PPV与2型圆环病毒(Porcinecircovirustype2,PCV2)协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要原因之一。近年来,随着我国规模化养猪业的发展和品种的引进.PPV感染呈扩大上升的趋势.给养猪业带来了巨大的经济损失。经初步调查,我国猪群中PPV血清阳性率高达92%左右。因此.为了保障我国养猪业的健康发展.加强对本病的检测具有十分重大的实际意义。

本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

一般情况下,如果一个猪场在同一时间内仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,其他猪无明显症状,同时有证据证明是一种传染病时,应该怀疑是PPV感染,并做进一步检测。 内容来自www.vetcn.net

1病毒学检查

内容来自www.vetcn.net

病毒的分离与鉴定

http://www.vetcn.net

1.1病料的采集和分离

http://www.vetcn.net

70日龄以内流产胎儿、死胎、木乃伊胎及弱仔的脑、肾、睾丸、肠系膜淋巴结或母猪的胎盘和阴道分泌物均可作为分离病毒的材料.以肠系膜淋巴结和肝脏分离率最高。病料加双抗处理,研磨至乳状,4℃冰箱过夜,3000r/min离心l0min,取上清液-20℃保存备用。准备猪肾原代或继代细胞,待细胞生长铺满至细胞瓶的1/3时,倾倒瓶内营养液.加入己处理好的病料上清lmL,37℃吸附1小时,期间每隔15min摇一次,加入无血清的维持液,继续培养3~6天,每天观察,直至细胞出现病变。未出现病变者,盲传3代.仍没有病变弃之。若有PPV存在,培养16~36小时的细胞核内可观察到包涵体.3-6天出现特征性细胞病变。病毒分离成功的关键在于是否同步接种,这是因为病毒主要在有丝分裂的S期细胞内复制,即同步接种后l6~48小时。也有人强调在种植细胞的4小时内必须将含病毒的样品加入到培养瓶中,否则病毒增殖不理想。 http://www.vetcn.net

1.2病毒鉴定

本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

①电镜观察 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

将出现明显病变的细胞经胰酶消化后,经离心、洗涤处理,包埋成小块用锇酸固定,经脱水、浸透及醋酸铀和柠檬酸铅正性染色后电镜检查。在细胞核内可见大量的病毒粒子,呈圆形,无囊膜,大小约20nm。

http://www.vetcn.net

②血凝及血凝抑制试验 内容来自www.vetcn.net

血凝试验:将出现病变的细胞培养物反复冻融3次,2000r/min离心10min,除去细胞碎片.在96微孔板上按1:22、1:23、…l:2n倍比稀释每孔加入50μL,再加入50μL的0.5%豚鼠红细胞混匀,4℃作用1~2小时判定结果,以50%的红细胞能发生凝集判为终点,样品出现凝集终点的最高稀释度定为HA滴度。血凝抑制试验:将血清在96微孔板上按l:22.1:23.…l:2n的比例倍比稀释,每孔加入50μl,再加入50μl4单位的抗原混匀作用30min后加入50μL的0.5%豚鼠红细胞,4℃作用1~2小时判定结果.以能完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度定为HI效价。该试验较为简单.易操作,是基层兽医检测PPV较为经典的方法。

内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

③间接免疫荧光法

本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

病毒分离不适合作常规的诊断方法,因为PPV的感染性在胎儿死后会缓慢的丧失,而且分离病毒耗时很长,甚至有时培养的细胞本来就已经污染。病毒分离和鉴定是PPV感染最为确切的诊断方法,但是费时费力,并且需要一定的技术条件和设备。另外,其感染力会随着胎儿死亡时间而降低.从而限制了临床应用。

内容来自www.vetcn.net

2血清学方法

内容来自www.vetcn.net

2.1血凝和血凝抑制试验

内容来自www.vetcn.net

2.1.1血凝(HA)试验:该试验即使在死亡时间较长、病毒无污染性的木乃伊胎中也可检出抗原。

内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

2.1.2血凝抑制(HI)试验:是检测PPV抗体最常用的方法.一般采用试管法和微量法。利用Hl检测人工感染PPV的猪.发现感染后5天即可以检测到相应抗体。l2~14天抗体滴度高达1024~4096.并能持续多年检出抗体。待检血清进行HI试验时需要首先进行灭活处理.然后再用红细胞吸附,以除去血清中的非特异性血凝素,再用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。该方法虽能快速、大量的诊断,但灵敏度低、特异性不强,在低滴度感染时难以检出.只能作为辅助诊断方法。

本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

2.2血清中和试验(SN) 内容来自www.vetcn.net

血清中和试验是最经典、传统的血清学方法,它特异、敏感。其原理是利用被检血清的抗体中和PPV,然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。Joo等HI通过试验发现,SN比HI更敏感,但操作复杂,首先要进行病毒感染力的测定,才能进行中和试验,而且低剂量不能引起细胞病变,因此完成一次中和试验常需一周或更长的时间,用于临床诊断时效性太差。中和试验需要细胞培养技术和病变结果的判断,需要较高专业技术,不利于一般实验室和临床推广应用。

内容来自www.vetcn.net

2.3间接免疫荧光技术 内容来自www.vetcn.net

早在1970年Cartwright等就用荧光显微镜检测细胞培养物中是否分离到了PPV。Morey等用HPvBl9囊膜蛋白单克隆抗体P92F5,以APAAP法进行免疫荧光染色,在石蜡包埋切片中检测到病毒抗原存在于胞核和胞浆中。这种方法可从长期保存的样品中检测到病毒。PPV的间接免疫荧光检测敏感、可靠.检测时间也短,一般几个小时就可完成检测。董齐等报道,将猪细小病毒高免血清和猪胎儿组织中的PPV抗原形成特异性的反应.再加兔抗猪IgG荧光抗体,建立了间接免疫荧光诊断技术.该技术应用于临床具有特异、敏感、快速的特点。

http://www.vetcn.net

2.4琼脂扩敖试验

http://www.vetcn.net

此法是一种操作简便.特异性较强的血清学诊断方法。可检查PPV抗原,也可检测PPV抗体。刘译等用此法取妊娠期延长、产死胎、木乃伊胎的初产母猪血清与抗原做常规琼脂扩散试验,结果均出现明显沉淀线。但GDP敏感性差.不能用于检测PPV抗原量少的样品。 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

2.5酶联免疫吸附试验 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1989年WesternbrinkF等建立了酶联免疫吸附试验(ELISA),经比较证明与HI的试验结果一致,并适用于大规模的样品检查。ShiraishiT等成功地建立用滤纸采取血样、用ELISA方法检测PPV抗体的方法,此法便于样品的采集和送检。Jenkins等应用酶联免疫吸附试验检测流产胎儿组织中的分布情况。张晓根等建立了间接Dot—ELISA.PPV抗原对纯化PPV抗体的最低检出量为2.5ng/点。阳性猪血清的特异性阻断试验及交叉反应试验证明.该方法对抗原的检测具有特异性。 内容来自www.vetcn.net

2.6乳胶凝集试验(LAT) 内容来自www.vetcn.net

何启盖等(l999)将灭活的PPV经硫酸铵沉淀、透析浓缩后的病毒液致敏乳胶建立了检测PPV抗体的乳胶凝集试验诊断方法。致敏的乳胶抗原与细小病毒阳性血清反应出现凝集颗粒。乳胶凝集试验可用于对临床大量血样进行血凝抑制试验前的初选,具有简便、准确的优点。该方法的不足之处在于它所检测的抗体主要是IgM,因此只能用于疾病的定性诊断.不能进行血清抗体滴度的监测。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

2.7 ELISA双抗夹心法 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

是一种操作简便、敏感、特异,可用于快速诊断PPV的研究。姜永厚等报道,建立了从胎猪脏器中检测抗原的ELISA双抗体夹心法,并摸索了最佳试验条件.结果认为选择胎猪病料时非常重要.以肝脏中含毒量最高。 http://www.vetcn.net

2.8免疫电镜试验

内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

责任编辑:兽医小编