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水貂肠炎病毒分子检测技术与基因工程疫苗研究进展

来源:网络 人气: 发布时间:2017-02-19
摘要:摘 要:水貂肠炎病毒(MEV)是一种自主复制性的最小的动物DNA病毒。研究表明,MEV是引起水貂病毒性肠炎的病原体,能够引起水貂剧烈腹泻,具有较高的发病率和死亡率。随着对水貂肠炎病毒研究的不断深入,目前已经在病毒病原学、结构与非结构蛋白、感染机制、

摘 要:水貂肠炎病毒(MEV)是一种自主复制性的最小的动物DNA病毒。研究表明,MEV是引起水貂病毒性肠炎的病原体,能够引起水貂剧烈腹泻,具有较高的发病率和死亡率。随着对水貂肠炎病毒研究的不断深入,目前已经在病毒病原学、结构与非结构蛋白、感染机制、诊断与疫苗防控等方面取得很大进展。文章主要针对MEV分子检测新技术与基因工程疫苗等方面进行了综述。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

关键词:水貂肠炎病毒;分子检测;基因工程疫苗;防控 http://www.vetcn.net

水貂肠炎病毒(Mink enteritisvirus,MEV)又名水貂细小病毒,是引起水貂以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病的病原体[1]。在自然条件下,不同品种和不同年龄的貂均有感染性,但幼貂的感染性极强。由MEV引起的水貂病毒性肠炎存在于世界各养貂国,该病最早于1949年由Schofield报道于加拿大,1952年由Wills分离鉴定了病原,并命名为水貂肠炎病毒,之后,美国、瑞典、荷兰、英国、法国、日本等相继报道[2]。我国自从1981年姜廷秀报道发生疑似水貂肠炎病毒性肠炎以来,高云、于永仁、张德礼、王金生、张振兴、李昌仁、闫喜军等人先后报道,辽宁、吉林、黑龙江、河北、山东、青海、内蒙等地均有该病发生,并从发病或死亡的水貂中分离获得多个MEV病毒株。随着特种养殖业的发展,病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖的三大疫病之一,给养貂业带来巨大的经济损失。

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1 MEV的一般特征

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MEV在分类地位上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)的成员,在同属中还有猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopenia virus,FPV),犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV-2),浣熊细小病毒(Raccoon parvovirus,RPV)和蓝狐细小病毒(Blue foxparvovirus,BFPV)等肉食兽细小病毒。MEV与FPV同源性非常高,认为是适应不同宿主的结果。MEV具有该属病毒的典型特征,呈20面立体对称结构,直径20nm~24 nm,无囊膜,分为实心和空心两种病毒颗粒,前者衣壳蛋白由VP1、VP2和VP33种结构蛋白组成,而后者只有VP1和VP2两种。MEV对外界因素有强大的抵抗力,对氯仿等脂溶性溶剂和胰蛋白酶有抵抗力。MEV是该属中血凝性较弱的病毒之一,仅在4℃,pH6.0~7.2条件下对猪和恒河猴的红细胞有凝集作用,也能凝集马和猫的红细胞,但Rivera等分离的MEV-S株对猪、猴或马、牛、恒河猴的红细胞均不表现凝集作用[2]。MEV能在猫肾细胞系等多种猫源细胞培养物及水貂肾、脾、心肌细胞株培养中增殖,产生细胞病变[3]。MEV为单股线性DNA分子,基因组长约5064nt,是动物DNA病毒中最小的。在基因组中含有两个主要的开放阅读框架,3′端编码结构蛋白,5′端编码非结构蛋白,即调节蛋白。2个启动子,分别位于图距单位37(37mu)和图距单位39(39mu)处,它能利用宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ分别启动结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NS1和NS2)编码基因的转录。VP1和VP2及NS1和NS2是通过同一条mRNA分别剪接后翻译形成的[4]。

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2 MEV的分子检测技术

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自1949年,Schofield等首次报道水貂病毒性肠炎以来,有关该病诊断方法的研究报告较多。从最初的病毒分离鉴定,到血凝及血凝抑制试验、琼脂扩散试验、荧光抗体染色技术、酶联免疫吸附试验等免疫学方法,直到核酸杂交、聚合酶链式反应等分子生物学技术。

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2.1 核酸杂交检测技术 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

核酸杂交技术是利用碱基互补原理来检测目的同源核苷酸片段,具有敏感性高、特异性强和诊断快速的特点。随着分子生物学技术的发展,核酸杂交技术被广泛地应用于各领域,如疾病诊断,特别是病毒病的诊断、基因杂交及文库筛选等。

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在国外,UttenthalA等[5]首次应用放射性同位素32P标记的探针杂交技术对试验中感染MEV的水貂进行分析。国内,赵永军等[6]建立了用放射性同位素和光生物素标记的核酸探针,率先将核酸杂交技术应用于水貂病毒性肠炎的诊断。该技术将应用分子克隆技术制备的MEV0.7kb大小的DNA片段以及含有该片段的重组质粒pBM用放射性同位素32P标记,用光生物素标记pBM,分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针。采用打点杂交技术检测5种肉食细小病毒和5种非细小病毒科病毒细胞培养物,以及33份貂、犬粪便样品,结果表明同位素32P标记的探针和光生物素标记的探针均具有相同的杂交特异性,与5种肉食兽细小病毒及感染细小病毒的貂、犬粪样呈杂交阳性反应,与其他科病毒及健康貂、犬粪样呈阴性。同位素32P和光生物素标记探针分别检出1pg和10pg貂肠炎病毒RF-DNA,敏感性比血凝试验分别高100倍和10倍,结果表明,这两种探针可作为肉食兽细小病毒临床诊断及流行病学调查的通用探针,而且这种方法对于检出长期潜伏感染、健康带毒动物和处于疾病早期或后期的动物具有重要意义。沈正达等[7]建立了光生物素标记核酸探针检测MEV的方法,将重组质粒pEH20用HindⅢ酶切获得的2.5kb的DNA片段,进行光生物素标记,用该探针对MEV细胞培养物及其自然感染病料和对照材料检测。探针只与MEVDNA杂交显色,而与犬瘟热病毒、黏膜病病毒、阿留申病毒等其他9种病毒核酸不能杂交显色,且与血清学检测结果一致。也证明了用光生物素标记的核酸探针灵敏度相当高,可以检测出10pg DNA的水平。

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2.2 聚合酶链反应检测技术

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聚合酶链反应(Polymerase chainreaction,PCR)技术诞生于1985年,是一种体外扩增特定DNA片段的技术,它能快速、特异地在体外扩增特定的DNA片段,使之在短时间(数小时)内特异地扩增数百万倍,由皮克达到微克水平,经凝胶电泳后成肉眼能直接观察到的核酸条带。

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刘维全等[8]根据肉食兽细小病毒核苷酸序列高度同源的特点,设计合成了一对通用引物,以CPV、FPV和MEV细胞培养物为DNA模板,进行PCR扩增,结果均得到0.6kb的核酸片段。结果表明,扩增产物与设计的2个引物之间的序列大小一致。通过通用性、特异性与敏感性试验及对临床送检样品检测,证明此方法对肉食兽细小病毒通用,且具有快速、特异和高度敏感的特点。张海玲等[9]根据GenBank中已经发表的MEV基因组序列,选择VP2基因的保守序列设计合成了一对特异性引物,建立了检测MEV特异性核酸的PCR诊断方法。经过敏感性及特异性检测,该引物能与MEV标准株和地方分离株核酸发生特异性结合,扩增出一段长度为570bp的DNA片段,而与犬瘟热病毒、阿留申病毒等病毒的PCR反应均呈阴性。表明设计引物可用于MEV的临床检测。DecaroN等[10-12]建立了快速、敏感和重复性高的RT-PCR,能够检测出粪便中的102~109数量级的DNA拷贝;随后又建立了能鉴别CPV疫苗毒和野毒的基于小沟聚合物(minorgroovebinder,MGB)荧光探针技术的RT-PCR;到2008年又发展了基于MGB探针的实时RT-PCR用于FPV和CPV的鉴别诊断。EliaG等[13]建立的实时RT-PCR用于检测CPVNS2的mRNA,能够在感染犬的多种组织中,包括中枢神经系统,检测出RNA拷贝,其检测范围为102~109数量级。 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

2.3 基因组的限制性内切酶图谱

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责任编辑:兽医小编