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苦参抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs损伤机理及有效成分研究

来源:网络 人气: 发布时间:2017-02-19
摘要:志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga liketoxin,SLT-Ⅱe)主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生,为猪水肿病的主要毒力因子。试验研究表明,SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(ratintestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs)的增殖,并可对其

志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga liketoxin,SLT-Ⅱe)主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生,为猪水肿病的主要毒力因子。试验研究表明,SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(ratintestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs)的增殖,并可对其造成一定损伤。而适宜苦参水煎液不但可以促进RIMMVECs增殖,更可以减弱SLT-Ⅱe对RIMMVECs的损伤。本试验通过对苦参水煎液及其主要成分与SLT-Ⅱe共同作用于RIMMVECs后,不同时间段细胞上清夜中NO、ET-1分泌量的检测,旨在从细胞水平探寻苦参抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs的损伤机理,并对其有效成分进行研究,为中药对抗细菌毒素及防治细菌病的研究提供理论基础。 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

1 材料与方法

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1.1 材料 内容来自www.vetcn.net

DMEM(Gibico);标准胎牛血清(Gibico);SLT-Ⅱe液(扬州大学微生物实验室惠赠);大鼠肠粘膜微血管内皮细胞(北京农学院中兽医实验室提供);NO试剂盒(深圳晶美);ET-1(内皮素-1)试剂盒(北京尚柏生物公司);噻唑蓝(MTT,Amresco);二甲基亚砜(DMSO,Sigma);所有试剂均经过0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

1.2 仪器

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培养板(Costar);96孔酶标板(Costar);CO2培养箱(Sanyo);荧光倒置数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);酶联免疫检测仪(BioRad);分光光度计(UNICO) 内容来自www.vetcn.net

1.3 方法

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1.3.1 细胞传代接种:选取第10代的细胞进行消化,所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5×104?个/mL,充分混匀后接种至96孔细胞培养板中,每个孔接种200 μl,然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

1.3.2 分组方案:共分5组,每组5个重复(其中12 h各细胞组在一块细胞培养板上)。分组及各组毒素与中药液终浓度如下。空白组:维持培养基;毒素组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 含量为10.0μg/m;毒素+苦参水煎液组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL,苦参200.0μg/mL;毒素+苦参碱组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL,苦参碱200.0μg/mL;毒素+氧化苦参碱组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL,氧化苦参碱200.0 μg/mL 内容来自www.vetcn.net

1.3.3 NO、ET-1的测定:将96孔细胞培养板置入CO2培养箱中,37 ℃静置培养24h,待细胞生长到80%铺满培养孔底壁。如分组剂量更换培养液后,继续培养。在细胞培养的3、6、9、12h,从各大组中选取一个小组的5个孔,吸出全部细胞培养液250 μl,3000 rpm离心10min后,将上清液移入新的小离心管中,封口,-20℃冰箱保存备用。依试剂盒说明书完成细胞上清液中NO、ET-1的测定,其中ET-1每组3个重复。

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1.3.4 12h增值率的测定:在12 h后,将12 h组的各孔细胞上清夜吸净后,加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150ml的DMEM维持培养基,继续培养4 h后,轻轻吸弃孔内液体,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃孵育30 min以上,使细胞内结晶充分溶解,于酶标仪570 nm波长测定细胞增殖率(OD值)。

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1.4 数据统计

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试验结果采用平均值±标准误表示,试验组间差异采用t检验法。

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2.结果

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2.1 苦参水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs增殖作用

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由表1可以看出,当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时,毒素作用RIMMVECs 12h后,MTT法测细胞增殖率OD值与空白对照组比较明显降低,且差异极显著。而毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组在12h时的OD值均显著高于毒素组,其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较无显著差异,而毒素+氧化苦参碱组与空白组比较差异极显著,与毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较差异亦极显著。

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表1 苦参水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs增殖作用( n = 5 )

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组别 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

X ± S copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

增殖率%

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统计结果

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空白组 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

2.88±0.12 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

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A?? a 内容来自www.vetcn.net

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毒素组 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

2.32±0.07 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

-19.53 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

C?? c http://www.vetcn.net

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毒素+苦参水煎液组

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2.79±0.06

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-2.95 内容来自www.vetcn.net

A?? a 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

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毒素+苦参碱组 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.80±0.07 内容来自www.vetcn.net

-2.61

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A?? a

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毒素+氧化苦参碱组 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.56±0.04 内容来自www.vetcn.net

-10.91 http://www.vetcn.net

B?? b

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注:各组间不含有相同大写字母表明差异极显著p<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著p<0.05

2.2 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影响

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由表2可以看出,空白组NO分泌量随着时间的增加而增加,呈逐渐上升的趋势,且上升趋势平缓。而毒素组,除在3h时,NO分泌量与空白组没有明显差异,在6h、9h、12h时均较空白对照组明显升高,且差异极显著。而在各个时间点,三个中药组毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组的NO分泌量均落在毒素组与空白组之间。3h时,各个组NO分泌量间没有明显差异。在6h时,三个中药组NO分泌量与毒素组比较,差异极显著;其中,毒素+苦参碱组与空白组比较差异显著。在9h时,三个中药组NO分泌量与毒素组比较,差异极显著;其中毒素+氧化苦参碱组与空白组比较差异极显著。12h时,三个组与毒素组比较,差异极显著,其中毒素+氧化苦参碱组与空白组差异极显著。三者间比较,除在12h时,毒素+苦参碱组与毒素+氧化苦参碱组间差异显著外,其他均无显著差异。 http://www.vetcn.net

表3-12 苦参水煎液及其成份SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影响(X±S μmol/L,n = 5)

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组别

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3 h copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

6 h

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9 h

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12h

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空白组 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

9.45±1.54 A a

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11.71±0.72 B c 内容来自www.vetcn.net

13.10±1.63 Cc

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15.11±1.67 C d

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毒素组 内容来自www.vetcn.net

10.08±1.61 A a copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

17.13±1.75 A a 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

18.14±1.21 A a 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

23.05±2.30 A a

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毒素+苦参水煎液组 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

9.70±1.00 A a

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12.59±1.26 Bbc

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14.61±1.29 BCbc

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17.88±1.70 BCbc

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毒素+苦参碱组

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9.95±1.13 A a

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13.60±1.14 B b http://www.vetcn.net

14.11±0.84 BCbc 内容来自www.vetcn.net

16.75±1.70 BCcd

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毒素+氧化苦参碱组

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9.82±1.31 A a copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

12.97±1.38 Bbc

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15.87±1.50 AB b 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

19.40±0.93 B b 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

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注:相同时间的组间不含有相同大写字母表明差异极显著p<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著p<0.05

2.3 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影响

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由表3可以看出,而对于ET-1的分泌量,空白组随着时间的增加而没有明显变化。毒素组,在3h时,ET-1分泌量与空白组比较明显降低,且差异极显著。而在6h、9h、12h时,毒素组ET-1又明显上升,与空白对照组比较差异极显著。对于中药组,在3h时,毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组、毒素+氧化苦参碱组的ET-1分泌量均高于毒素组,且差异极显著;其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组与空白组比较差异极显著。三者间比较,毒素+氧化苦参碱组与其他两组比较差异极显著。从6h后,三个中药苦参组ET-1的分泌量即落在毒素组与空白组之间。在6h时,三个组ET-1分泌量与毒素组和空白组比较,差异均极显著。三者间比较差异都极显著。在9h时,三个中药组ET-1分泌量与毒素组和空白组比较,差异均极显著。三者间比较,毒素+氧化苦参碱组与其他两组比较差异极显著。12h时,三个中药组ET-1分泌量与空白组比较,差异极显著;其中毒素+苦参水煎液组、毒素+苦参碱组ET-1分泌量与毒素组比较,差异极显著。三者间比较差异都极显著。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

表3-13 苦参水煎液及其成份对SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影响(X±S pg/mL,n = 3)

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组别 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

3 h

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6 h

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9 h

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空白组 内容来自www.vetcn.net

1.73±0.12 B b 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

1.99±0.11 E e 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.06±0.15 D d 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

2.01±0.14 D a

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毒素组 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

0.90±0.11 C c

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6.62±0.14 A a

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7.10±0.16 A a

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6.62±0.21 A a http://www.vetcn.net

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毒素+苦参水煎液组

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2.09±0.14 A a

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5.18±0.20 C c 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

5.18±0.15 C c copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

5.13±0.21 B b 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

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毒素+苦参碱组 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.16±0.14 A a

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4.69±0.11 D d

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4.97±0.23 C c 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

3.88±0.11 C c

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毒素+氧化苦参碱组 http://www.vetcn.net

1.71±0.11 B b http://www.vetcn.net

5.77±0.07 B b

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5.99±0.14 B b 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

6.36±0.11 A d

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注:相同时间的组间不含有相同大写字母表明差异极显著p<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著p<0.05

3 分析与讨论 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

责任编辑:兽医小编