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穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO及ET-1的影响

来源:网络 人气: 发布时间:2017-02-19
摘要:志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病(ED)的主要致病因子[1,2]。目前的研究显示:SLT-Ⅱe致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激,引发细胞分泌机能的改变,释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[3]。NO与ET-1是由血管内皮

志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病(ED)的主要致病因子[1,2]。目前的研究显示:SLT-Ⅱe致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激,引发细胞分泌机能的改变,释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[3]。NO与ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的因子,分别有舒张和收缩血管的作用[4,5]。血管内皮细胞通过调控NO与ET-1的释放平衡来调节血管的功能[6]。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

穿心莲内酯为爵床科植物穿心莲的有效成分。现代药理学研究表明,穿心莲内酯具有调节血管舒缩[7]、抗血栓及血小板聚集[8]等多种作用,对机体内微循环的调节具有重要意义。本试验旨从大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMMVECs)分泌NO与ET-1的角度,探讨SLT-Ⅱe具体的致病机制以及穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe损伤RIMMVECs的作用机制。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1材料与方法

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1.1材料

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DMEM(Gibico);标准胎牛血清(Gibico);SLT-Ⅱe粗提物(扬州大学微生物实验室提供);穿心莲内酯标准品(中国药品生物制品检定所);大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(北京农学院实验室提供);NO试剂盒(深圳晶美公司);ET-1试剂盒(上海尚柏生物公司)。

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1.2方法 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1.2.1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞传代培养

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选取第10代的细胞进行消化, 所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5 ×104 个?mL-1,充分混匀后接种至96孔的培养板中,每个孔接种0.2 mL,然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。

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1.2.2试验前细胞计数 http://www.vetcn.net

培养48h 后,定时消化三孔细胞作计数,当细胞数量增至1×105 个?mL-1 时,用于实验。 内容来自www.vetcn.net

1.2.3分组方案 内容来自www.vetcn.net

各孔细胞分为空白对照组、SLT-Ⅱe组、SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe+穿心莲内酯2组。空白对照组加DMEM维持培养基,其余三组加含有10μg?mL-1 SLT-Ⅱe的DMEM维持培养基,2h后再向SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe+穿心莲内酯2组分别加入终浓度为5 μg?mL-1、20μg?mL-1的穿心莲内酯液,置于CO2 培养箱中静置培养。 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

1.2.4取样

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每组分6 h、12 h、18 h三个观测点,在各时间点取样测定细胞上清液中NO和ET-1的含量。

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1.2.5测定

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NO的测定用硝酸还原酶法,按照试剂盒说明操作,使用分光光度计于530 nm 处检测。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

ET-1的测定用ELISA法,按照试剂盒说明操作,使用酶标仪于450 nm 处检测。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1.2.6数据统计

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采用SPSS11.0统计软件处理。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

试验结果采用平均值±标准误表示,试验组间差异采用t检验法。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

2结果 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.1不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响 http://www.vetcn.net

表1 不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响(治疗组)(±S μmol?L-1)(n=3)

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组别

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6 h 内容来自www.vetcn.net

12 h

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空白对照组 http://www.vetcn.net

12.82±1.75

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14.73±2.84 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

16.45±2.31 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

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SLT-Ⅱe组

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16.45±0.88

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19.50±3.19

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32.68±2.29**

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SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组

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15.49±2.30

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21.22±2.06**

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31.34±2.82** http://www.vetcn.net

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SLT-Ⅱe+穿心莲内酯2组 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

17.02±3.26 内容来自www.vetcn.net

15.69±2.32 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

16.25±4.8△ http://www.vetcn.net

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注:与空白组对照,** p<0.01,* p<0.05;SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组,SLT-Ⅱe+穿心莲内酯 http://www.vetcn.net

2组对照,△△ p<0.01,△ p<0.05。

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2.2不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

表2 不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响(治疗组)(±S pg?mL-1)(n=3)

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组别

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?6 h

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12 h

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18 h

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空白对照组

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1.33±0.55

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2.32±0.45

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2.91±0.61

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SLT-Ⅱe组

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10.27±1.21** 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

9.56±1.41**

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8.35±0.89**

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SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组 内容来自www.vetcn.net

10.31±0.81** 内容来自www.vetcn.net

9.93±1.33**

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7.71±0.59**

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SLT-Ⅱe+穿心莲内酯2组 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

12.47±1.19**△△ copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

13.08±0.53**△△ 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

13.67±0.61**△△

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注:与空白组对照,** p<0.01,* p<0.05;SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组、SLT-Ⅱe+穿心莲内酯

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2组对照,△△ p<0.01,△ p<0.05。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

3讨论

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NO与ET-1之间均以cGMP为中介,两者之间存在着反馈性调节[9],共同维持着正常的血管舒缩。两者分泌量一旦发生紊乱,势必破坏机体内正常微循环的进行。由表1和表2看出,SLT-Ⅱe组中NO的分泌量仅仅在第18h极显著高于空白组,在第6、12 h与空白组无显著差异;ET-1在第6、12、18h与空白组相比均极显著升高。分析原因可能是,微血管内皮细胞在受到SLT-Ⅱe刺激后,通过自身的保护机制发挥作用,ET-1首先开始分泌,以抑制NO—cGMP途径,使NO的分泌量在12h内未显著升高,细胞内的cGMP水平也未明显升高。作用一段时间后,SLT-Ⅱe逐渐发挥毒性作用,而细胞自身的保护力逐渐下降,出现了失代偿的状况,ET-1逐渐无法遏制NO的合成,NO大量分泌,ET-1反被NO抑制,分泌量呈逐渐下降的趋势。NO在18h达到分泌高峰,并通过NO—cGMP 途径,使细胞内的cGMP水平增高而导致血管舒张,进而使机体发生水肿。由此我们认为,SLT-Ⅱe致病机制主要是作用其靶细胞——微血管内皮细胞后,细胞通过自身保护力首先分泌ET-1来抑制NO分泌量的升高,但最终毒素的持续作用使细胞失去自身保护力,NO大量分泌导致微血管舒张,间隙增大,组织液进入组织间隙的量增多,造成组织水肿。在SLT-Ⅱe的致病机制中,NO是主要的致病因子,而ET-1作为与NO作用相反的细胞因子,在一定程度上可能起着保护微血管内皮细胞的作用。

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穿心莲内酯目前已经成为抗心血管疾病常用中药之一。有研究表明,穿心莲内酯具有调节血管舒缩的作用[10]。由表1和表2可以看出,SLT-Ⅱe+穿心莲内酯1组(5μg?mL-1穿心莲内酯)中NO的分泌量逐渐升高,且在12、18h高于空白组,差异极显著,较SLT-Ⅱe组差异不显著;ET-1分泌量各时间段均较空白组高,且呈略微下降趋势,较SLT-Ⅱe差异均不显著。分析原因可能是,5μg?mL-1穿心莲内酯对SLT-Ⅱe作用后的微血管内皮细胞保护力较弱或没有保护力。5μg?mL-1穿心莲内酯作用后,微血管内皮细胞迅速分泌ET-1,但是ET-1的分泌量较SLT-Ⅱe组没有显著的升高,无法抑制NO—cGMP途径,NO大量分泌,cGMP水平升高从而导致细胞的损伤。SLT-Ⅱe+穿心莲内酯2组(20μg?mL-1穿心莲内酯)中NO分泌量略有降低,在各时间段与空白组均无显著差异,而在18h显著低于SLT-Ⅱe组;ET-1分泌量略有升高,各时间段极显著高于空白组,且极显著高于SLT-Ⅱe组。分析原因可能是,20μg?mL-1可以使ET-1在18 h内均保持较高的分泌量,抑制了NO—cGMP途径,使NO无法大量分泌,且分泌量能够回复到生理状态时的水平,进而起到保护微血管内皮细胞的作用。近年来穿心莲内酯对心血管方面的药理研究很多,但试验多以主动脉、脐静脉等为研究对象,对微血管方面的药理作用研究甚少。本试验的结果表明,不仅仅是对大动脉、大静脉,穿心莲内酯对机体的微血管同样有一定的调节作用。虽然具体的作用机制尚不清楚,但基本上可以认定,穿心莲内酯是通过刺激细胞分泌对细胞有保护作用的ET-1,来抑制SLT-Ⅱe刺激后分泌的主要的致病因子——NO的合成,从而达到治疗效果。这一结论再次验证了之前“在SLT-Ⅱe的致病机制中,NO是主要的致病因子,ET-1对内皮细胞有一定的保护力”的推测。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

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