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SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响

来源:网络 人气: 发布时间:2017-02-19
摘要:志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病(ED)的主要致病因子[1]。目前的研究显示:SLT-Ⅱe的致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激,引发细胞分泌机能的改变,释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[2]。NO是血管内皮细胞产生

志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病(ED)的主要致病因子[1]。目前的研究显示:SLT-Ⅱe的致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激,引发细胞分泌机能的改变,释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[2]。NO是血管内皮细胞产生的内皮衍生性舒张因子,具有抗血小板聚集和中性粒细胞黏附的作用,对机体的微循环发挥着重要的调节作用[3 ]。

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为了研究微血管内皮细胞在猪水肿病发病机制中的作用,本试验以大鼠肠黏膜微血管内皮细胞为介质,观察了SLT-Ⅱe对其分泌细胞因子NO的影响,旨在了解SLT-Ⅱe对肠黏膜微血管内皮细胞的损伤机制。 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

1材料与方法

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1.1材料 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

DMEM(Gibico);标准胎牛血清(Gibico);SLT-Ⅱe液(扬州大学微生物实验室提供);大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(北京农学院实验室提供);NO试剂盒(深圳晶美公司)。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1.2方法 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

1.2.1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞传代培养

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选取传至第10代的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞进行消化,所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5×104个?mL-1,充分混匀后接种至96孔的培养板中,每个孔接种0.2 mL,然后置入CO2 培养箱中静止培养48h。 内容来自www.vetcn.net

1.2.2试验前细胞计数

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培养48 h后,定时消化三孔细胞作计数,当细胞数量增至1 ×105 个?mL-1 时,用于试验。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.2.3分组 内容来自www.vetcn.net

将各孔细胞分为空白对照组、SLT-2e 1组、SLT-2e 2组、SLT-2e3组,每孔设复孔3个,分别加入含0μg?mL-1、2μg?mL-1、10μg?mL-1、50μg?mL-1SLT-2e的DMEM维持培养基,置于CO2培养箱中静置培养。 内容来自www.vetcn.net

1.2.4取样 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

每组分6h、12h、18h、24h四个观测点,在各时间点取样测定细胞上清液中NO的含量。 http://www.vetcn.net

1.2.5测定

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NO的测定用硝酸还原酶法,按照试剂盒说明操作于530nm 处检测. 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.2.6数据统计 内容来自www.vetcn.net

试验结果采用平均值±标准误表示,采用SPSS11.0统计软件处理,试验组间差异采用t检验法。 http://www.vetcn.net

2结果

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不同浓度SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞NO分泌的影响结果见表1。由表1可以看出,SLT-2e 1组(2μg?mL-1)在6h、12 h、18 h和24 h时,NO的分泌量无显著变化;SLT-2e2组(10μg?mL-1)在12 h、18 h和24h时,NO分泌量均显著或极显著升高;SLT-2e3组(50μg?mL-1)在各时间段均极现状升高,说明一定浓度的SLT-2e能够作用于微血管内皮细胞,使其分泌NO的量增加。 内容来自www.vetcn.net

表1. 不同浓度SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)分泌NO的影响 (n=3) http://www.vetcn.net

组别6 h12 h18 h24 h 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

空白对照组9.58±0.8711.29±3.6812.05±17111.10±1.44 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

SLT-2e 1组 (2μg?mL-1)10.72±1.7511.86±1.1910.15±2.8712.81±2.38 http://www.vetcn.net

SLT-2e2组(10μg?mL-1)11.10±3.1517.40±1.32*35.93±2.31**36.11±2.50**

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SLT-2e3组(50μg?mL-1)19.31±4.03**26.95±2.29**24.28±4.67**26.38±5.98**

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**p<0.01,*p<0.05

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3讨论

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已有研究表明,猪水肿病的致病过程分为3 个阶段:(1)致猪水肿病大肠埃希菌感染易感猪;(2)细菌以其F18ab( F107)菌毛黏附于小肠上皮细胞;(3)细菌在肠道内定居和增殖,产生志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)并被吸收,最终导致感染猪发病[4]。SLT-Ⅱe在本病的发生过程中起着重要作用,它可通过直接或间接的途径激活或损伤肠黏膜微血管内皮细胞,致其结构和功能发生变化,如血管的舒缩、黏附分子的表达以及屏障功能损伤等[5]。

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NO是血管内皮细胞分泌的重要细胞因子之一,具有舒张血管的作用。一旦出现体内NO分泌不足或过量,都会对机体微循环造成严重损伤,进而引发各种疾病[6]。本试验结果表明,肠黏膜微血管内皮细胞在生理状态下也分泌一定量的NO,以维持微血管内皮细胞功能的稳定。于培养基中添加一定量的SLT-Ⅱe后,10μg?mL-1和50μg?mL-1组在6-24h时,NO分泌量均显著升高,表明SLT-Ⅱe能够作用于微血管内皮细胞,刺激其对NO的分泌量增加。NO是舒张血管物质,其含量的升高,将使血管舒张,血管间隙增加,血管内的液体成分更易于渗出到血管外,导致水肿的发生,这也证明产志贺样大肠杆菌引起水肿病的机理就是通过其分泌的SLT-Ⅱe作用于肠黏膜微血管内皮细胞,致使微血管内皮细胞对NO的分泌增加而发挥致病作用的。 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

从本试验的结果可以发现,浓度为50μg?mL-1 的SLT-2e作用于细胞后,NO的分泌量在6 h和12h即显著高于10μg?mL-1组,而在18 h和24 h时,则显著低于,这可能是因为50μg?mL-1浓度较高,作用于细胞后,在短时间内即导致其NO的分泌大量增加,但随着作用时间的延长,部分细胞因毒素的作用而死亡,因此在18 h和24h时NO的分泌量反而较10μg?mL-1组为低。由试验结果还可以看出,2μg?mL-1组各时间段NO的分泌量始终处于一个比较恒定的水平,其原因可能于本组毒素浓度较低,对微血管内皮细胞的损伤较小或没有损伤有关。 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

综上所述,我们认为SLT-2e损伤肠黏膜微血管内皮细胞,使其NO分泌增加是仔猪水肿病发生的机制之一。 内容来自www.vetcn.net

责任编辑:兽医小编