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槐花水煎液抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs损伤的保护效果研究

来源:网络 人气: 发布时间:2017-02-19
摘要:志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga liketoxin,SLT-Ⅱe)主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生,为猪水肿病的主要毒力因子。目前的研究表明,微血管内皮细胞上带有的SLT-Ⅱe特异性受体[2],且SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(ratintestinal mucosa microvascu

志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga liketoxin,SLT-Ⅱe)主要由出血性大肠杆菌(EHEC)产生,为猪水肿病的主要毒力因子。目前的研究表明,微血管内皮细胞上带有的SLT-Ⅱe特异性受体[2],且SLT-Ⅱe能抑制大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(ratintestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs)的增殖,并可对其造成一定损伤。本试验通过对不同浓度槐花水煎液单独及与SLT-Ⅱe共同作用后,RIMMVECs的增殖率及NO分泌量的观察,探讨中药抗SLT-Ⅱe的作用机理,为防治猪水肿病的中药筛选和中药抗细菌毒素的机理研究提供理论依据。 内容来自www.vetcn.net

1.材料与方法

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1.1材料 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

DMEM(Gibico);标准胎牛血清(Gibico);SLT-Ⅱe液(扬州大学微生物实验室惠赠);槐花(购自北京同仁堂药店);大鼠肠粘膜微血管内皮细胞(北京农学院中兽医实验室提供);NO试剂盒(深圳晶美);噻唑蓝(MTT,Amresco);二甲基亚砜(DMSO,Sigma);所有试剂均经过0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。

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1.2仪器

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培养板(Costar);96孔酶标板(Costar);CO2培养箱(Sanyo);荧光倒置数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);酶联免疫检测仪(BioRad);分光光度计(Unico) 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.3方法

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1.3.1细胞传代接种:选取第10代的细胞进行消化,所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5×104?个/mL,充分混匀后接种至96孔细胞培养板中,每个孔接种200 μl,然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。 http://www.vetcn.net

1.3.2 药液处理:精确称量干燥槐花100 g,常法煎煮两次。经旋转蒸发仪浓缩成1︰1浓度的药液。4℃保存。使用前,用维持培养基稀释至所需浓度。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.3.3 槐花对RIMMVECs的效用试验:细胞传代至96孔细胞培养板,37℃、CO2培养箱中静置培养,待细胞生长到80%铺满培养孔底壁,选取5组共25孔的细胞用于试验。吸弃原培养基,在各组中分别加入含100.0、10.0、1.0、0.1、0mg/mL槐花的维持培养基200μl,记为槐花1组、槐花2组、槐花3组、槐花4组和空白组。37 ℃静置培养24h后,将96孔细胞培养板置入CO2培养箱中,37 ℃静置培养24 h。吸出全部细胞培养液,3000 rpm离心10min,将上清液移入新的小离心管中,封口,-20℃冰箱保存。依试剂盒说明书完成细胞上清液中NO的测定。在吸净细胞上清夜的各孔细胞中加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150ml的DMEM维持培养基,继续培养4 h后,轻轻吸弃孔内液体,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃孵育30 min以上,使细胞内结晶充分溶解,于酶标仪570 nm波长测定细胞增殖率(OD值)。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.3.4槐花抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs损伤的作用试验:细胞处理同前,选取5组共25孔细胞进行试验,分别记为空白组、毒素组、毒素+槐花1组、毒素+槐花2组、毒素+槐花3组。各组加入含不同成分的维持培养基200μl,各组所含毒素及槐花浓度如下:空白组:维持培养基;毒素组:维持培养基中SLT-Ⅱe 含量为10.0μg/mL;毒素+槐花1组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL,槐花5.0mg/mL;毒素+槐花2组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0μg/mL,槐花0.5mg/mL;毒素+槐花3组:维持培养基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL,槐花0.05 mg/mL。增殖率及NO分泌量的测定同上。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

1.4数据统计 http://www.vetcn.net

试验结果采用平均值±标准误表示,试验组间差异采用t检验法

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2.结果 copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

2.1 槐花对RIMMVECs的增殖效果试验

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由表1可以看出,不同浓度槐花水煎液作用于RIMMVECs 24 h后,槐花1组(100 mg/ mL)、槐花2组(10 mg/mL)、槐花3组(1 mg/mL)OD值均小于空白组,且差异极显著,对RIMVECs增殖呈抑制作用,三组之间差异亦极显著。槐花4组(0.1 mg/mL)OD值大于空白对照组,且差异极显著,表现出对RIMVECs的保护、增殖作用,增殖率达14.67%。

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表1 槐花对RIMMVECs的增殖效果试验

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组别X ± S增殖率%统计结果 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

空白组1.60±0.07—B? b

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槐花1组0.04±0.02-97.81E? e 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

槐花2组0.70±0.08-55.96D? d 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

槐花3组1.24±0.07-22.49B? b

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槐花4组1.83±0.0814.67A? a

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注:各组间不含有相同大写字母表明差异极显著p<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著p<0.05

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2.2 槐花对RIMMVECs分泌NO的影响

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由表2可以看出,槐花1组与槐花2组对RIMVECs作用24h后,所测NO分泌量与空白对照组比较,差异极显著,与槐花其他两组比较差异极显著,二者之间差异亦极显著。槐花3组NO分泌量与空白对照组比较,无明显差异。槐花4组NO分泌量分泌与空白对照组比较,差异显著(P<0.05)。但槐花3、4组间无明显差异。 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

表2? 槐花水煎液对RIMMVECs分泌NO的影响(X±S μmol/L,n = 5)组 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

组别X ± S统计结果 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

空白组10.02±1.10C?? d 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

槐花1组66.01±2.32A ??a copyright www.vetcn.net 中国兽医信息网

槐花2组17.21±1.40B?? b

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槐花3组12.02±1.80C ?cd 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

槐花4组12.50±1.64C ??c

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注:? 各组间不含有相同大写字母表明差异极显著P<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著P<0.05 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

2.3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs增殖率的影响

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由表3可以看出,当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时,毒素作用细胞24h后,MTT法测细胞增殖率OD值低于空白对照组,二者相比较,差异极显著,其对细胞增殖抑制率达29.07%。对于槐花组,毒素+槐花1组OD值与空白对照组比较差异显著,与毒素组比较差异不显著。毒素+槐花2组与空白对照组比较差异不显著,与毒素组比较差异显著。毒素+槐花3组与空白对照组比较,差异显著,与毒素组比较差异极显著。槐花3个组OD值则随着槐花浓度增加呈现出先升高再降低的趋势。槐花三个组之间比较差异均极显著。其中只有毒素+槐花2组与槐花三个组比较无明显差异,其他两组均差异极显著。

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表3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs增殖率的影响 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

组别X ± S增殖率%统计结果

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空白组2.40±0.100A? ?a 内容来自www.vetcn.net

毒素组1.70±0.11-29.07C?? c http://www.vetcn.net

毒素+槐花1组1.72±0.09-28.39C?? c

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毒素+槐花2组2.30±0.07-4.20A?? a 本文来自中国兽医信息网www.vetcn.net

毒素+槐花3组2.00±0.14-16.60B?? b 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

注:? 各组间不含有相同大写字母表明差异极显著P<0.01,各组间不含有相同小写字母表明差异显著P<0.05 内容来自www.vetcn.net

2.3 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs分泌NO的影响 http://www.vetcn.net

由表4和图4可以看出,当SLT-Ⅱe浓度为10 μg/mL时,毒素作用RIMMVECs 24h后,细胞上清液中NO的分泌量与空白对照组比较增加明显,且差异极显著。对于槐花组,毒素+槐花1组、毒素+槐花2组与空白组比较差异极显著,而与毒素组比较无显著差异。毒素+槐花3组与空白组比较差异不显著,但与毒素组比较差异极显著。槐花组相应的NO分泌量随槐花浓度的降低而逐渐降低,三个组之间,毒素+槐花1组与毒素+槐花2组比较无显著差异,与毒素+槐花3组比较差异显著,毒素+槐花2组与毒素+槐花3组间比较差异显著。 http://www.vetcn.net

表4 槐花水煎液与SLT-Ⅱe共同作用对RIMMVECs分泌NO的影响 本文来自中国执业兽医资格考试网www.vetcn.net

组别X ± S统计结果 内容来自www.vetcn.net

空白组14.20±2.31C ???d

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毒素组24.32±4.16A ???a 内容来自中国执业兽医师网www.vetcn.net

毒素+槐花1组22.95±1.73A ???ab

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毒素+槐花2组20.57±1.77AB ?bc http://www.vetcn.net

毒素+槐花3组17.95±2.19BC ??d http://www.vetcn.net

3.分析与讨论

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责任编辑:兽医小编