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蛋、种鸡沙门氏菌的净化研究

来源:生物资源与生态环境教育部重点实 人气: 发布时间:2016-10-31
摘要:1 引言 沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,沙门氏菌病是具有重要公共卫生意义的人畜共患病之一,禽蛋、禽肉产品是其重要传播媒介。本实验室调查表明,我国部分鸡场鸡白痢沙门氏菌抗体阳性率在0%~33%之间,分离出肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。鸡沙门氏
1 引言
沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,沙门氏菌病是具有重要公共卫生意义的人畜共患病之一,禽蛋、禽肉产品是其重要传播媒介。本实验室调查表明,我国部分鸡场鸡白痢沙门氏菌抗体阳性率在0%~33%之间,分离出肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌属中一个或多个成员所引起的急性或慢性疾病,其病原包括鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒等,种鸡感染沙门氏菌可经蛋垂直传播和水平传播,雏鸡鸡沙门氏菌病的发病率10%~100%,经济严重损失。沙门氏菌可通过卵巢、输卵管污染鸡蛋,在肠道内定植的沙门氏菌,在加工胴体时污染鸡肉,沙门氏菌进入人类食物链,已成为各国引起人食物中毒致死亡的重要病原,如2010 年,美国3000 多人因为食用感染沙门氏菌的鸡蛋而发病,美国因此召回5.5 亿枚问题鸡蛋进行销毁。为了保障蛋、种鸡养殖健康和蛋品、肉品安全,国家蛋鸡产业技术体系把蛋、种鸡沙门氏菌的净化,作为重点任务开展研究。目前鸡场沙门氏菌净化存在的主要问题是:(1)缺乏快速、准确、灵敏的蛋鸡沙门氏菌病原和抗体高通量检测技术;感染后排菌和抗体产生的规律不清楚。(2)种鸡(原种、父母代)净化不彻底,净化规程不完善,在商品鸡中感染放大。(3)鸡场饲料、饮水、环境中沙门氏菌的二次污染,保持阴性鸡群难度大。2009-2016 年以来,本实验室围绕这些科学问题,开展相关研究及进展如下。
2 材料和方法
2.1 沙门氏菌流行病学调查
2009-2011 年,采用鸡白痢全血平板凝集试验,对17 个蛋、种鸡场10127 份鸡全血样品进行了检测。2012 年采用鸡白痢全血平板凝集实验对我国10 家蛋、种鸡场3387 份全血样品进行了检测;2007 年3月-2015 年,采集我国不同地区规模化蛋鸡场的饲料、肛拭子、病死鸡组织器官、毛蛋、粪样等22089份样品,进行鸡源沙门氏菌分离鉴定;采用丹麦Statens Serum Institut(SSI)生产的沙门氏菌鉴定血清对分离沙门氏菌进行血清型鉴定;采用KB 纸片法、E-test、MIC 测定等方法检测沙门氏菌耐药表型。采用PCR 扩增方法检测沙门氏菌的对多种抗生素及消毒药的耐药基因。对沙门氏菌多重耐药基因岛1进行了克隆测序及功能研究。
2.2 沙门氏菌检测方法的研究
改进了沙门氏菌增菌液,在蛋白胨缓冲水中加入胱氨酸,使沙门氏菌处于生存竞争优势,从而提高检测灵敏度,缩短富集时间。优化增菌后,结合PCR 检测样品中是否存在沙门氏菌。研究化沙门氏菌LAMP 检测技术,在LAMP 体系中加入优化配制的钙黄绿素——MnCl2 溶液作为指示剂,根据颜色变化肉眼判定结果。采用化学共沉淀法制备磁珠载体,与沙门氏菌特异性抗体进行偶联,制备沙门氏菌特异性免疫磁珠,将其加入到待测样品中,捕获沙门氏菌,与多重PCR 技术结合,优化磁珠+PCR 检测沙门氏菌的方法条件。化学合成肠炎沙门氏菌适配体,与荧光染料NMM 结合形成G 四链体,产生显著增强的荧光信号,研究基于新型生物传感器沙门氏菌的快速检测方法。
2.3 蛋、种鸡场鸡沙门氏菌溯源研究
对鸡场中空气、饮水、饲料中沙门氏菌污染情况进行溯源:对鸡舍空气进行沙门氏菌分离、对空去总菌数进行了评价。分别在各级处理采集水样及鸡的饮水乳头位置采集水样,分离沙门氏菌。进行了蛋鸡场饲料中沙门氏菌分离,对鸡舍中捕获鼠进行沙门氏菌分离鉴定。
2.4 蛋、种鸡场沙门氏菌的净化规程及生物安全措施研究
通过对蛋、种鸡场的调查,采用全血平板凝集试验检测淘汰阳性鸡,研究了采样检测的时间、检测样本数量及判定标准,为制定净化规程提供依据。在鸡舍墙脚外面铺50CM 的碎石防鼠进入,堵住鸡蛋传送带、鸡粪传送带等可能的鼠通道,全封闭式管道给料系统让饲料不见天,避免鼠的污染。使用鸡粪传送带使鸡粪不落地,避免环境细菌总数增加。测定15 种消毒剂对从鸡舍分离的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢的MIC、MBC 值,筛选安全有效的消毒剂。根据对鸡舍空气细菌总数评价及模型建立,找出半开放鸡舍、全封闭测定鸡舍空气细菌总数的采样点,以鸡舍空气中可培养总细菌数不超过25000CFU/M3 为判定依据,研究了半开放鸡舍、全封闭(4、6、8 层)鸡舍在夏季、冬季的消毒剂量、间隔时间,为制定消毒规范提供依据。在实验室条件下,在饲料中加入浓度为4.4 ×105cfu/g 的沙门氏菌,模拟饲料制粒温度80℃ 20~30sec 处理后,检测对沙门氏菌是否有杀灭作用。采用罗曼粉蛋鸡,分为颗粒料组、粉料组各1200 只,正式饲喂时间161d,评价用颗粒料和粉料饲养蛋鸡的死淘率、好蛋率、成本等指标,探究颗粒料对蛋鸡沙门氏菌的净化是否有益。
3 结果和讨论
3.1 沙门氏菌流行病学调查结果表明
2009-2011 年,17 个蛋、种鸡场10127 份鸡全血样品沙门氏菌抗体阳性率从0 到33%。 2012 年,鸡白痢全血平板凝集实验对我国10 家蛋、种鸡场3387 份全血样品进行了检测阳性率差异从0.5%到24.9%。我国健康鸡群的标准:祖代鸡沙门氏菌抗体阳性率控制在0.1%以下,父母代鸡沙门氏菌抗体阳性率控制在0.3%以下,有较大差距,认为有比较重点开展沙门氏菌净化。2007 年3 月-2015 年,从各鸡场样品中分离鉴定鸡源沙门氏菌467 株,血清型鉴定结果表明:肠炎沙门氏菌(S. Enteritidis)、鸡白痢沙门氏菌(S. Pullorum)、都柏林沙门氏菌(S. Dublin)、卡拉巴尔沙门氏菌(S. Calabar)为优势血清型。对2007-2015 年蛋、种鸡场沙门氏菌耐药表型检测结果显示,其对多西环素(DO)、氟苯尼考(FFC)、复方新诺明(SXT)、氨苄西林(AMP)耐药率较高;对头孢西丁(FOX)、亚胺培南(IPM)耐药率较低,养殖内环境分离的沙门氏菌对抗生素耐药率36.51%~100%,高于养殖外环境的沙门氏菌对抗生素耐药率12.25%~100%,耐药基因检测结果表明:blaTEM 在养殖内环境中检出率最高57.14%,blaCTX-M耐药基因在鸡蛋包装环节检出率最高16.67%,blaCMY-2、blaSHV、qnrS 耐药基因仅在养殖内环境中检测出,qacEΔ1 耐药基因在养殖内环境中检出率最高76.19%。鸡蛋生产链中沙门氏菌对抗生素、消毒剂共同耐药严重。2015 年,首次在鸡源沙门氏菌中发现多粘菌素耐药基因mcr-1 和超光谱beta-内酰胺类酶基因共存于同一个质粒上。通过对分离的禽源沙门氏菌耐药表型分析,沙门氏菌分离株的多重耐药率高达53.77%,率先开展了沙门氏菌多重耐药基因岛1 的研究,首次证实lnuF、dfrA25、qnrB2、 dfrA17、aadA5 五个耐药基因存在于SGI1 中。 发现了5 个SGI1 新亚型,分别命名为SGI1-W、SGI1-X、SGI1-Y、SGI1-B2 和SGI1-Z,阐明耐药基因盒的同源重组是SGI1 新亚型产生的主要机制,沙门氏菌基因岛1(Salmonella genomic island(SGI)-1)是沙门氏菌中一个42.4 kb 的可移动基因岛,由27.4-kb 的骨架和15-kb 的多重耐药区域(MDR)构成,是介导多重耐药的重要水平转移元件,基因岛介导的多重耐药性已成为各国研究的新热点。
责任编辑:王红宁